Введение
Глава I. Обзор литературных данных
1.1. Методы направленного мутагенеза in vitro
1.1.1. Получение локализованных мутаций в результате рекомбинации фрагментов ДНК 7
1.1.2. Индукция локализованных мутаций путем химической модификации однонитевых участков ДНК . 14
1.1.3. Индукция локализованных мутаций путем введения модифицированных нуклеотидов 21
1.1.4. Индукция локализованных мутаций с помощью неполностью комплементарных ДНК-матрице олигонуклеотидных затравок 24
1.1.5. Индукция направленных мутаций с помощью комплементарных полинуклеотидов, несущих алкилирующие группы. ..... 26
1.1.6. Направленный мутагенез in vivo.
Подходы и перспективы 34
1.2. Ген, ответственный за устойчивость к тетрациклину плазмиды pBR322 - эксперимен
тальная мишень для направленного мутагенеза 38
Заключение к главе 1 43
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы 44
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение ДНК 48
2.2.2. Выделение фрагментов рестрикции ДНК. . 50
2.2.3. Бведение радиоактивной метки во фрагменты ДНК. 51
2.2.4. Гидролиз EooRI-BamHI
фрагмента рестрикции ДНК экзонуклеазой III из E.coli
для получения однонитевых фрагментов. . 55
2.2.5. Присоединение полифункционального алкилирующего реагента ТВД к молекулам ДНК 55
2.2.6. Гибридизация нуклеиновых кислот. . 56
2.2.7. Внутрикомплексное алкилирование. . 59
2.2.8. Денатурация гибридных комплексов. . 59
2.2.9. Хроматография ДНК на оксиапатите. . 59
2.2.10. Трансформация клеток E.coli
ДНК плазмидн pBR322 60
2.2.11. Определение первичной последовательности ДНК 60
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Присоединение алкилирующего реагента ТШ к ДНК. Устойчивость алкилированных оснований. . 64
3.2. Исследование способности ДНК, модифицированной ТШ, к комплементарному комплексообра-зованию 66
3.3. Разработка метода направленной модификации генов, клонированных в плазмидах 73
3.3.1. Получение однонитевой ДНК-носителя алкилирующих групп 74
3.3.2. Разработка метода гибридизации ДНК-носителя алкилирующих групп с суперспирализо-
ванной ДНК плазмиды 78
3.4. Получение направленных мутаций в гене Тсг плазмиды pBR322 84
3.5. Определение характера изменений в
первичной структуре полученных мутантов 88
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Использование ДНК в качестве носителя алкилирующих групп 93
4.2. Эффективность и направленность разработанного метода мутагенеза 96
4.3. Определение характера индуцированных мутаций. Предполагаемый механизм их возникновения. . . 97
4.4. Вероятная эволюционная роль механизма, индуцирующего образование тандемных повторов 103
Глава 5. Заключение 107
Глава 6. От автора 108
Выводы 109
Список использованной литературы ..... III
