Введение
Обзор литературы 11
1 Фитазы бактерий как основа новых биотехнологий 12
1.1 Классификация и свойства фитаз 14
1.1.1 Гистидиновые кислые фитазы (HAPs) 16
1.1.2 -Пропеллерные фитазы (BPPs) 19
1.1.3 Цистеиновые фосфатазы (CPs) 21
1.1.4 Пурпурнокислые фитазы (РАРs)
1.2 Распространенность фитаз в живой природе 25
1.3 Биологические функции фитаз
2 Распространенность фитата, локализация и функции 35
3 Гетерологичные системы экспрессии на основе генов фитаз 46
3.1 Оптимизация гетерологичной экспрессии фитаз в растениях 51
3.2 Кодон-оптимизация генов для гетерологичной экспрессии 52
3.3 Свойства рекомбинантных фитаз, экспрессируемых растениями 54
4 Агробактериальная трансформация растений 56
4.1 Бинарные векторные системы 64
4.2 Arabidopsis thaliana – модельный организм для изучения рекомбинантной экспрессии 67
Заключение 69
Экспериментальная часть 71
Материалы и методы 71
1 Штаммы и культуры бактрий з
2 Плазмиды и конструкции экспрессионных систем 71
3 Трансформация бактерий 75
4 Растения Arabidopsis thaliana 77
5 Агробактериальная трансформация растений 78
6 Выделение геномной ДНК растений 79
7 Выделение тотальной РНК растений 81
8 Получение кДНК 82
9 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 10 Электрофорез ДНК 85
11 Выделение белкового экстракта из тканей растений 85
12 Электрофорез в ПААГ 86
13 Вестерн-блоттинг 86
14 Определение фитазной активности 87
15 Характеристика растений при росте на средах
с разными источниками фосфора 88
16 Геноинформатика 90
17 Статистическая и компьютерная обработка данных 90
Результаты 91
1 Получение растений Arabidopsis thaliana с интегрированным геном бактериальной фитазы Pantoea agglomerans под управлением конститутивного промотора 91
1.1 Создание гетерологичного вектора экспрессии гена бактериальной фитазы 91
1.2 Получение рекомбинантного штамма Agrobacterium tumefaciens с интегрированным геном бактериальной фитазы 96
1.3 Агробактериальная трансформация растений A. thaliana и получение гомозиготных по интегрированному гену фитазы линий растений 97
2 Анализ экспрессии гена бактериальной фитазы в растениях A. thaliana 101
2.1 Экспрессия бактериальной фитазы в растениях на транскрипционном и трансляционном уровне 101
2.2 Активность бактериальной фитазы, экспрессируемой растениями 105
3 Характеристика растений, экспрессирующих модифицированную бактериальную фитазу 107
3.1 Влияние гетерологичной экспрессии на жизнеспособность семян растений 107
3.2 Влияние гетерологичной экспрессии на рост и морфологию модифицированных растений 108
3.3 Содержание фосфора в тканях растений при росте на среде с фитатом 118
Обсуждение результатов 122
Заключение 133
Список сокращений 135
Список литературы
