Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1 Историческая справка и характеристика возбудителя бруцеллеза 12
1.2 Лабораторная диагностика бруцеллеза 19
1.3 Применение молекулярно-генетических технологий для индикации и идентификации возбудителя бруцеллеза
Собственные исследования 40
Глава 2 Материалы и методы 40
2.1 Объекты исследования 40
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 40
2.1.2 Реактивы, питательные среды, диагностические препараты
2.2 Культивирование микроорганизмов 49
2.3 Проведение идентификации выделенных культур бруцелл бактериологическими методами 2.3.1 Способность к образованию сероводорода 50
2.3.2 Определение редуцирующей активности в отношении красителей 50
2.3.3 Агглютинация моноспецифическими сыворотками 50
2.4 Подготовка проб 50
2.4.1 Приготовление бактериальных взвесей 50
2.4.2 Подготовка проб биологического материала, пищевых продуктов и проб из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных Brucella spp. и гетерологичными микроорганизмами 51
2.4.3 Подготовка проб биологического материала от животных с подозрением на бруцеллез
2.5 Обеззараживание проб 53
2.6 Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб биологического материала, пищевых продуктов и проб из объектов окружающей среды 54
2.7 Проведение полимеразной цепной реакции 54
2.7.1 Проведение ПЦР с системой AMOS-ERY 54
2.7.2 Проведение ПЦР с системой Bruce-Ladder 55
2.7.3 Проведение ПЦР с системой Suis-Ladder
2.8 Проведение амплификации omp генов с последующей рестрикцией 57
2.9 Базы данных и программы для анализа нуклеотидных последовательностей
2.10 Проведение полногеномного секвенирования и сравнительного филогенетического анализа 58
2.11 Статистическая обработка полученных данных 58
ГЛАВА 3 Разработка набора реагентов для определения видовой принадлежности бруцелл методом пцр с учетом результатов в режиме реального времени 59
3.1 Подбор ДНК-мишеней для определения видов бруцелл методом ПЦР-РВ 59
3.2 Подбор оптимальных условий мультилокусной амплификации выбранных видоспецифичных локусов и конструирование генодиагностического препарата 70
3.3 Характеристика чувствительности и специфичности разработанного набора реагентов для определения видовойпринадлежности бруцелл методом ПЦР-РВ 74
ГЛАВА 4 Совершенствование способов идентификации видов бруцелл методом пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 78
4.1 Уточнение видовой принадлежности использованной ранее выборки штаммов бруцелл 78
4.2 Поиск новых ДНК-мишеней и разработка способа определения видовой принадлежности основных шести видов бруцелл методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 85
ГЛАВА 5 Оценка эффективности разработанных подходов и других молекулярно-генетических методов для определения видовой принадлежности природных штаммов возбудителя бруцеллеза 90
Глава 6 Апробация комплекса молекулярно-генетических методов для идентификации возбудителя бруцеллеза при исследовании биологического материала от сельскохозяйственных животных и выделенных культур патогена 101
6.1 Апробация комплекса молекулярно-генетических методов при исследовании проб биологического материала, выделенных от животных на территории Саратовской области 101
6.2 Апробация генодиагностического препарата и способа определения видовой принадлежности бруцелл методом ПЦР-РВ при исследовании проб биологического материала от крупного рогатого скота на территории Гвинейской Республики 105
Заключение 108
Выводы 114
Перечень сокращений, условных обозначений 115
Список использованной литературы
