Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Бешенство животных 17
1.1.1. Сравнительная оценка методов диагностики бешенства животных 17
1.1.2. Методы прямого обнаружения антигена вируса бешенства 18
1.1.3. Методы выделения вируса бешенства 23
1.1.4. Сравнительная оценка диагностической пригодности тестов 25
1.2. Лабораторная диагностика лептоспироза.. 27
1.2.1. Краткая характеристика основных методов диагностики 27
1.2.2. Рестрикционный анализ как таксономический метод 31
1.2.3. ДНК-ДНК гибридизация в диагностике лептоспироза 33
1.3. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота 34
1. 3.1. Введение 34
1.3.2. Диагностика инфекционного ринотрахеита КРС 36
1.3.2.1. Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита 36
1.3.2.2. Иммуноферментный метод для диагностики инфекционного ринотрахеита 39
1.3.2.3. Диагностика ИРТ с помощью гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции 40
1.3.3. Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых 42
1.3.3.1. Общие положения в диагностике инфекции 42
1.3.3.2. Иммуноферментный анализ в диагностике вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС) 48
1.3.4. Лабораторная диагностика PC инфекции 52
1.3.5. Лабораторная диагностика парагриппа-3 56
1.3.5.1. Серодиагностика и ретроспективная диагностика 56
1.3.5.2. Сравнение методов серодиагностики парагриппа-3 59
1.3.6. Диагностика аденовирусной инфекции 60
1.3.6.1. Серологическая идентификация 62
1.3.6.2. Серодиагностика PI ретроспективная диагностика 65
2. Собственные исследования 66
2.1. Материалы и методы 66
2.1.1 .Штаммы 67
2.1.2.Инфекционность вируса 68
2.1.3 .Культуры клеток и среды 68
2.1 ААнтитела и антигены .* 69
2.1.5 .Сыворотки 70
2.1.6.Выделение и очистка Ig G 71
2.1.7.Непрямой иммуноферментный анализ 71
2.1.8.Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы ИФА л... 72 -
2.1.9.Молекулярное клонирование ДНК L. pomona 72
2.1.10.Статистическая обработка результатов 73
3. Результаты собственных исследований 74
3.1.Усовершенствование технологии получения антирабической сыворотки для промышленного производства диагностических ФИТЦ-коньюгатов 74
3.2. Молекулярное клонирование ДНК L.interrogans серовара pomona для идентификации и дифференциации лептоспир 76
3.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир 76
3.2.2. Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара pomona 77
3.2.3. Получение фрагментов ДНК L. interrogans серовара pomona 78
3.2.4. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид 81
3.2.5. Анализ рекомбинантных плазмид в реакции ДНК-ДЬЖ гибридизации 81
3.2.6. Применение рекомбинантных плазмид для идентификации и дифференциации лептоспир 88
3.2.6.1. Применение плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 для идентификации референтных штаммов лептоспир 88
3.2.6.2. Получение ДНК-зондов для идентификации полевых изолятови производственных штаммов лептоспир 93
3.2.6.3. Определение специфичности ДЬЖ L.pomona на коллекции штаммов различных видов микроорганизмов 94
3.2.6.4. Дифференциация производственных штаммов лептоспир 96
3.3. Разработка технологии получения компонентов комплексной тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антител-к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ЬЗД-БС, PC и АВ 102
3..3.1. Промышленное культивирование клеток ПТ-80 103
3.3.2. Очистка и концентрирование вирусов и получение антигенов для ИФА 104
3.3.2.1. Вирус парагриппа-3 . 104
3.3.2.1.1. Репродукция вируса парагриппа-3, штамм «ЗКСМ» 104
3.3.2.1.2. Очистка и концентрирование вируса ПГ-3 106
3.3.2.1.3. Получение антигена для иммуноферментного анализа ПГ-ЗЬСРС 117
3.3.2.1.4. Изучение белков вируса ПГ-3 из вируссодержащих суспензий 117
3.3.2.2. Получение аденовирусных антигенов для ИФА 119
3.3.2.3. PC-вирус 120
3.3.2.3.1. Репродукция PC-вируса, штамм «Randall» 120
3.3.2.3.2. Очистка и концентрирование PC-вируса 123
3.3.2.4.ВирусИРТ 129
3.3.2.4.1. Репродукция вирусаИРТКРС 129
3.3.2.4.2. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС 130
3.3.2.5. Вирусная диарея-болезнь слизистых 140
3.3.2.5.1 .Очистка и концентрирование ВД-БС 140
3.3.3. Культивирование St. aureus и очистка протеина А 141
3.3.4. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови КРС 143
3.3.5. Получение анти-IgG КРС гипериммунной сыворотки 146
3.3.6. Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) 147
3.3.7. Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена 150
3.3.8. Получение специфических к вирусам ИРТ, ПГ-3,ВД-БС, PC, АВ и отрицательной референс сывороток КРС 153
3.3.8.1. Получение специфических к вирусам сывороток крови 153
3.3.8.2. Получение отрицательной референс-сыворотки крови 155
3.3.9. Постановка, учет и критерий оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к ., антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ 157
3.3.9.1. Оптимизация условий постановки комплексной иммуноферментной тест-систем 157
3.3.9.2. Определение рабочего разведения сывороток 159
3.3.9.3. Определение оптической плотности (ОП450) контрольных сывороток 161
3.3.9.4. Определение критериев оценки результатов ИФА 162
3.3.10. Контроль воспроизводимости результатов определения антител комплексной тест-системой ИФА 165
3.3.11. Оценка эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ в сравнении с методами аналогичной направленности 165
3.3.12. Исследование молозива коров на наличие антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ в комплексной тест-системе ИФА 171
3.3.13. Применение комплексной иммуноферментной тест-системы для серологического мониторинга респираторных болезней КРС... 172
4. Обсуждение результатов исследований 174
5. Выводы 210
6. Практические предложения 213
7. Список литературы 216
Приложение 256
