Введение
Глава1. Обзор литературы .12
1.1.Биологическая характеристика хламидий 12
1.2. Таксономическое положение хламидий 13
1.3. Генетические особенности C.trachomatis .14
1.4. Жизненный цикл хламидий 16
1.4.1. Образование хламидийных включений 18
1.4.2. Секретируемые факторыхламидий .23
1.5. Протеасомный белок C.trachomatis 28
1.5.1 Субстратная специфичность белка CPAF 28
1.5.2. Структурная характеристика белка CPAF 31
1.5.3. Секреция белка CPAF через Sec-зависимый путь .35
1.6. Ингибирование белка CPAF .39
1.7. Разработка антихламидийных препаратов на основе подавления протеасомного белка .42
Заключение 44
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Штаммы, клеточные линии и плазмидные вектора .46
2.1.2. Реактивы для синтеза и модификации ДНК .46
2.1.3. Общелабораторные реагенты .46
2.1.4. Питательные среды .47
2.1.5.Буферные растворы .48
2.1.6. Лабораторное оборудование 49
2.1.7. Предоставляемые материалы .50
2.2. Методы .50
2.2.1. Культивирование микроорганизмов 50
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК 51
2.2.3.Постановка полимеразной цепной реакции .51
2.2.3.1. Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле 53
2.2.4. Молекулярное клонирование гена cpaf в Escherichia coli 53
2.2.5. Делетирование сигнальной последовательности в гене cpaf 55
2.2.6. Мутагенез гена Cpaf 54
2.2.7. Трансформация клеток Escherichia coli .55
2.2.7.1. Выделение и очистка белка из культуры E.coli 56
2.2.8. Трансформация клеток S. cerevisiae .57
2.2.8. 1. Выделение белка CPAF из культуры S. cerevisiae .58
2.2.9. Определение токсического фенотипа у дрожжей «drop test» методом .58
2.2.10. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF 59
2.2.11. Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле 59
2.2.11.1. Окрашивание SDS-полиакриламидного геля серебром 59
2.2.12. Определение ферментативной активности белка CPAF .60
2.2. 13. Выбор мишеней и поиск их ингибиторов методами компьютерного моделирования .62
2.2.14. Определение цитотоксического эффекта химических соединений методом окрашивания клеток метиленовым синим 63
2.2.15. Определение цитотоксического эффекта химических соединений в МТТ-тесте 64
2.2.16. Метод суспензионного заражения эукариотических клеток 64
2.2.17. Определение влияния химических соединений на внутриклеточное размножение хламидий .65
2.2.18. Определение ингибирующей активности низкомолекулярных соединений методом иммуноблоттинга .66
2.2.19. Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. Результаты собственных исследований 68
3.1. Клонирование гена cpaf в штаммы E. coli и выделение активного белка CPAF .68
3.2. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF 74
3.3. Получение рекомбинантного белка CPAF в биологически активной форме 74
3.4. Оценка ферментативной активности белка CPAF .77
3.5. Клонирование гена cpaf в Saccharomyces cerevisiae 81
3.5.1. Изучение токсического эффекта CPAF с использованием S.cerevisiae .83
3.5.2. Получение вариантов дрожжей с повышенной устойчивостью к действию CPAF .85
3.6. Выбор химических соединений – ингибиторов CPAF на основе виртуального скрининга 88
3.6.1. Изучение токсичности химических соединений на основе стандартных токсикологических тестов 89
3.6.2. Изучение влияния химических соединений на развитие хламидийной инфекции в культуре клеток .94
3.6.3. Изучение влияния химических соединений на протеолитическую активность белка CPAF .98
3.7. Выбор новых низкомолекулярных соединений, являющихся структурными аналогами выбранных «лидерных» химических соединений 101
3.7.1. Оценка токсичности для эукариотических клеток новых синтезированных соединений 106
3.7.2.Изучение влияния новых синтезированных соединений на внутриклеточное развитие хламидий в культуре клеток 108
3.7.3. Оценка влияния отобранных низкомолекулярных соединений на протеолитическую активность белка CPAF 111
Глава 4. Обсуждение результатов .113
ВЫВОДЫ .123
Список использованной литературы .124
