Введение
1. Структурно-функциональная организация рибосомы в процессе элонгации 8
1.1. Структурно-функциональная организация бактериальной рибосомы
1.1.1. Общее строение рибосомы 8
1.1.2. мРНК-связывающий центр 12
1.1.3. Расположение молекул тРНК в А-, Р- и Е-участках рибосомы 16
1.1.4. Декодирование мРНК 20
1.1.4.1. Структурные основы взаимодействия кодон-специфичной тРНК в А-участке 22
1.1.4.2. Роль фактора элонгации Ти 25
1.1.5. Образование пептидной связи 27
1.1.6. Транслокация 31
1.1.6.1. Модели транслокации 31
1.1.6.2. Роль фактора G 37
1.1.7. Механизмы действия некоторых антибиотиков 40
1.1.8. Сравнение данных по структурной организации активных центров, полученных методом аффинной модификации и РСА 44
1.1.8.1. мРНК-связывающий центр 44
1.1.8.2. тРНК-связывающие участки 47
1.2. Некоторые аспекты структурно-функциональной организации рибосом эукариот 49
1.2.1. Структурно-функциональная организация рибосом дрожжей 49
1.2.2. Структурно-функциональная организация рибосом высших эукариот 52
1.2.3. мРНК-связывающий центр рибосом человека 54
1.3. Заключение 57
2. Расположение кодонов мРНК в А-, Р- и Е-участках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания 59
2.1. Результаты
2.1.1. Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов 59
2.1.2. Модельные комплексы 80S рибосом с аналогами мРНК 60
2.1.3. Анализ сшивок аналогов мРНК 64
2.1.3.1. Анализ сшивок с 18SpPHK 66
2.1.3.2. Анализ сшивок с тРНК 66
2.1.4. Определение участков 18S рРНК, содержащих нуклеотиды, сшитые с аналогами мРНК 69
2.1.4.1. Определение участка сшивки аналога мРНК IV с 3-концевой последовательностью 18SpPHK 74
2.1.4.2. Определение участка сшивки аналога мРНК V с 3-концевой последовательностью 18SpPHK 77
2.1.5. Определение нуклеотидов 18S рРНК, сшитых с аналогами мРНК 78
2.1.6. Определение белков, сшитых с аналогами мРНК I, II и III 82
2.2. Обсуждение результатов модификации 80S рибосом фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU 86
2.2.1. Взаимодействие производного pUUAGUAUUUAUU с 18S рРНК в составе комплекса с 80S рибосомой, образованного в отсутствие тРНК 87
2.2.2. А-, Р- и Е-участки мРНК-связывающего центра 80S рибосомы 89
2.2.3. Сшивки производного pUUAGUAUUUAUU с тРНК 93
2.2.4. Соотнесение данных по аффинной модификации 80S рибосом человека реакционноспособными аналогами мРНК со структурой мРНК-связывающего центра рибосом бактерий 94
2.3. Заключение 98
3. Экспериментальная часть 100
3.1. Материалы 100
3.2. Выделение рибосомных 40S и 60S субчастиц из плаценты человека 101
3.3. Синтез фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина 103
3.4. Введение радиоактивной метки на 5-конец 104
3.5. Гидролиз РНКазой ТІ 105
3.6. Дефосфорилирование тРНК 105
3.7. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК в присутствии тРНК 106
3.8. Фотоаффинная модификация 80S рибосом производными pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU 108
3.9. Разделение модифицированных 80S рибосом на субчастицы 108
3.10. Выделение рРНК из 80S рибосом 108
3.11. Установление района 18S рРНК, содержащего участок сшивки с аналогом мРНК, с помощью гидролиза РНКазой Н 109
3.12. Выделение З-концевого фрагмента 18S рРНК, содержащего сайт сшивки с производным pUUUGUU3OMe, и введение радиоактивной метки по 3-концу этого фрагмента 109
3.13. Ограниченный щелочной гидролиз и гидролиз РНКазой U2 110
3.14. Определение модифицированных нуклеотидов в 18S рРНК с помощью метода обратной транскрипции 111
3.15. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью одномерного гель-электрофореза 112
3.16. Гидролиз протеиназой К и РНКазой А 112
3.17. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью двумерного гель-электофореза 113
Выводы 114
