Введение
1. Молекулярные аспекты взаимодействия белков семейства С5-цитознновых ДНК-мстилтрансфсраз и семейства Сго-белков и репрессоров с ДНК 11
1.1. Классификация ДНК-связывающих белков 11
1.2. Строение и свойства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз 13
1.2.1. Функции ДНК-метилтрансфераз 14
1.2.1.1. Биологическое значение метилирования ДІЖ в прокариотах 14
1.2.1.2. Биологическое значение метилирования ДНК в эукариотах 15
1.2.2. Первичная структура С5-іштозшіовьк ДНК-мстилтрансфсраз 17
1.2.3. Пространственная структура С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз 20
1.2.4. Механизм катализа переноса мстилыюй группы С5-цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами 24
1.2.5. Молекулярные механизмы взаимодействия С5-цитозиновых ДНК-метилтрапсфсраз с ДНК-субстратом и кофактором 28
1.2.5.1. Особенности связывания ДНК С5-цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами 28
1.2.5.2. Структурные аспекты ДНК-белкового узнавания в комплексах С5-ЦИТОЗИНОВЫХ ДНК-метилтрапсфсраз 30
1.3. Строение и свойства Сго-белков и репрессоров 34
1.3.1. Структурный мотив «спираль-иоворот-спираль» 35
1.3.2. Представители, входящие в семейство Сго-белков и репрессоров 38
1.3.3. Биологические функции фаговых репрсссоров и Сго-бслков. Регуляция генов в жизненном цикле бактериофага X 39
1.3.4. Структура Сго-бслков и репрсссоров 43
1.3.5. Механизм связывания Cro-белков и репрессоров с ДНК 45
1.3.6. Белок-белковые взаимодействия в структурах Cro-белков и репрсссоров 49
2. С5-цнтозшіопан ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с про.чоториой областью генов системы рестрикции-модификации SsoII 54
2.1. Разработка методики определения пеметилирусмого остатка 21-дезоксицитидипа в участке метилирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз 55
2.1.1. Установление специфичности действия ДНК-мстилтрансфсразы NlaX 59
2.2. Фермент модификации SsoII как С5-цитозиновая ДНК-мстилтрансфсраза 64
2.2.1, Равновесное связывание мстилтрансферазы SsoII с участком метилирования 67
2.2.2, Идентификация групп атомов участка метилирования, взаимодействующих с мстшпрансферазой SsoII при формировании специфического комплекса 73
2.2.2.1, Взаимодействие мстилтрансферазы SsoII с ^модифицированными ДНК-субстратами 73
2.2.2.2. Взаимодействие метилтрансферазы SsoII с ДНК-субстратами, содержащими З-мстил-З-дезоксицитидип водной из цепей участка метилирования 78
2.2.3, Роль Cysl42 каталитического центра мстилтрансферазы SsoII в связывании ДНК 84
2.3. Изучение роли метилтрансферазы SsoII в процессе дезаминирования метилируемого цитозииа 96
2.4. Регуляция в системе рестрикции-модификации SsoII. Фермент модификации SsoII как регуляторі или белок 100
2.4.1. Исследование равновесного связывания метилтрансферазы SsoII с «регуляториым» участком ДНК 102
2.4.2. Идентификация групп атомов «регуляторного» участка ДНК, взаимодействующих с метилтрансферазой SsoII при формировании специфического комплекса 103
2.4.3. Ковалсптпос присоединение метилтрансферазы SsoII к ДНК- лигаидам, содержащим 2*-альдегидпую группу 107
2.5. Анализ ДНК-белковых контактов в комплексах метилтрансферазы SsoII с «регуляторным» участком и участком метилирования 114
2.6. Моделирование ДНК-белковых взаимодействий в комплексах метилтрансферазы SsoII с «регуляторным» участком и участком метилирования 115
3. Экспериментальная часть 125
3.1. Реактивы и материалы 125
3.2. Приборы и методы 127
3.3. Общие методики 129
3.3.1. Введение згР-мстки в ДНК 129
3.3.2. Определение пуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК 129
3.3.3. Исследование равновесного связывания ДНК-метилтрансфсразы SsoII с ДНК-лигапдами 130
3.3.4. Метод «отпечатков» с использованием ІЧ-зтил-М-нитрозомочевиньї в качестве модифицирующего реагента 130
3.3.5. Метод «отпечатков» с использованием диметилсульфата в качестве модифицирующего реагента 131
3.3.6. Метод «отпечатков» с использованием муравьиной кислоты в качестве модифицирующего реагента 132
3.3.7. Метод «отпечатков» с использованием гидразина в качестве модифицирующего реагента 132
3.3.8. Ковалентное присоединение ДНК-метилтрансфераз NlaX и SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим 5-фтор-2*-дезоксицитидин 132
3.3.9. Ковалентное присоединение ферментов нуклеинового обмена к ДНК-дуплексам, содержащим фосфорилднсульфидную межііуклеотидиуга группу 133
3.3.10. Ковалентное присоединение ДНК-мстилтрансферазы SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим 2-альдегидную группу 133
3.3.11. Определение эффективности взаимодействия метилтрансфераз NlaX и SsoII с ДНК-субстратами 134
3.3.12. Определение нсметилируемого остатка 2-дезоксицитидина в участке узнавания цитозиновыхДНК-метилтраисфераз 134
3.3.13. Молекулярное моделирование 135
Выводы 139
