Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 18
1.1. Перспективы применения онколитических векторов 18
1.1.1. Введение 18
1.1.2. Генная терапия как метод лечения опухолей головного мозга 19
1.1.3. Молекулярные и структурные основы конструирования генно-инженерных векторов 20
1.1.4. Литические вирусные векторы направленного действия: общие принципы 22
1.1.5. Онколитические векторы на основе вирусов животного происхождения 23
1.1.6. Онколитические векторы на основе генома вирусов человека 25
1.2. Онколитические векторы в нейроонкологии 29
1.2.1. Введение 29
1.2.2. Молекулярные основы построения противоопухолевых онколитических векторов, применяемых в нейроонкологии 30
1.2.3. Усиление направленной инфекции онколитических вирусов: связывание с клеточным рецептором и интернализация 31
1.2.4. Транскрипционный контроль аденовирусной инфекции в глиомах 33
1.2.5. Стратегии, повышающие противоопухолевый эффект вектора 37
1.3. Роль сурвивина в диагностике и терапии глиобластомы человека 39
1.3.1.Введение 39
1.3.2. Общая характеристика и механизм действия 41
1.3.3. Регуляция экспрессии белка сурвивина 42
1.3.4. Клиническое значение экспрессии сурвивина для диагностики опухолей головного мозга 43
1.3.5. Терапевтические подходы таргетинга сурвивина 45
ГЛАВА 2.Материалы и методы 48
2.1. Клинический материал 48
2.2. Клеточные линии 48
2.2.1. Перевиваемые клеточные линии 48
2.2.2. Первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома» 49
2.2.3. Типирование клеток глиобластомы
2.3. Химические реагенты 50
2.4. Получение и характеристика аденовирусных векторов
2.4.1. Получение и характеристика аденовирусных векторов, дефектных по репликации 51
2.4.2. Использование онколитических вирусов ONYX015 и 24 51
2.5. Титрование аденовирусных векторов 54
2.5.1. Определение оптической плотности вирусной суспензии 54
2.5.2. Бляшкообразование 55
2.5.3. Определение инфекционного титра методом окраски клеточного монослоя антителами против гексона аденовируса 2.6. Биоинформатический анализ экспрессии генов с использованием баз данных TCGA, Oncomine и Rembrandt 56
2.7. Флуороцитометрический анализ клеточных популяций
2.7.1. Экспрессия клеточных рецепторов 56
2.7.2. Анализ аутофагии 57
2.7.3. Анализ клеточного деления 58
2.7.4. Детекция апоптоза с использованием антител против Аннексина 58
2.7.5. Клеточное разделение с использованием FACS 59
2.8. Количественный ПЦР 59
2.8.1. Количественный ПЦР клеточных и вирусных мРНК 59
2.8.2. Количественный ПЦР клеточных микроРНК 60
2.8.3. Количественный анализ экспрессии генов методом ПЦР в 96-луночном планшете (Array) 61
2.8.4. Количественный анализ экспрессии клеточных микроРНК методом ПЦР в 96-луночном планшете (miFinder Array-микрочип) 61
2.9. Определение экспрессии клеточных и вирусных антигенов с помощью иммунофлуоресценции 62
2.9.1. Клетки глиобластомы 62
2.9.2. Цитологический метод окрашивания клеток, имеющих фрагментацию ДНК 2.10. Определение клеточной цитотоксичности с помощью электронного микроскопа 63
2.11. Ангиогенез: формирование тубул 64
2.12. Анализ экспрессии ангиогенных факторов в клеточных лизатах 64
2.13. Анализ экспрессии клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга в ПААГ 64
2.14. Определение токсичности реагентов in vitro окраской красителем трипановым синим 65
2.15. Определение клеточной пролиферации и токсичности с помощью МТТ-реагента
2.15.1. Ингибирование пролиферации клеток вирусом 66
2.15.2. Ингибирование пролиферации клеток в присутствии химиопрепаратов
2.16. Детекция поврежденных клеток в реакции клеточной цитотоксичности (LDH) 67
2.17. Детекция поврежденных клеток с помощью окраски кристаллвиолетом 68
2.18. Инфекция клеточных культур in vitro 68
2.19. Тестирование цитотоксического действия реагентов in vivo 69
2.20. Создание систем in vivo для тестирования терапевтических препаратов
2.20.1. Использование внутримозговой модельной системы глиобластомы человека 70
2.20.2. Подкожная модель глиомы человека 71
2.21. Окрашивание тканевых срезов 71
2.21.1. Окрашивание срезов гематоксилин-эозином 71
2.21.2. Иммуногистохимическое окрашивание тканей 72
2.21.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание тканевых срезов 72
2.22. Статистический анализ 73
Глава 3. Результаты исследований 74
3.1. Генная терапия – экспериментальный подход в лечении глиобластомы головного мозга 74 3.1.1. Роль белка фибера аденовируса в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов 83
3.1.2. Генетическое клонирование фибера аденовируса человека типа 3 в геном рекомбинантного вектора обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы человека 93
3.1.3. Сурвивин – активный компонент резистентности глиобластомы к терапии темозоломидом и ионизирующей радиацией 100
3.2. Онколитический вирус CRAd-S-5/3 демонстрирует высокую избирательную токсичность по отношению к глиобластоме 110
3.2.1.Определение эффективности генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 с использованием внутримозговых моделей глиобластомы человека 123
3.3. Способы усиления терапевтического эффекта онколитического вектора in vitro и in vivo 127
3.3.1. Усиление вирусной репликации 3 CRAd-S-5/3 верапамилом 127
3.3.2. Механизм клеточной смерти, вызываемой онколитическим вирусом CRAd-S-5/3 130
3.3.3. Применение тамоксифена, как индуктора аутофагии 149
3.3.4. Регуляция программируемой клеточной смерти клеточной микроРНК 7d 154
3.3.5. Использование стандартных методов лечения: ионизирующая радиация и темозоломид для усиления активности онколитического вектора 158
3.3.6. Влияние Р53 на цитотоксичность онколитического вируса в комбинации с темозоломидом 162
3.3.7. Роль Hh-GLI сигнальных путей резистентности к онколитическому вектору 165
3.3.8. Использование CRAd-S-5/3 в качестве платформы для доставки генетического материала в клетки глиобластомы, резистентные для темозоломида и ионизирующей радиотерапии 167
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 177
Заключение 191
Выводы 194
Список используемых сокращений и терминов 197
Список использованной литературы 199
