Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Применение нитрита натрия в производстве мясных продуктов 11
1.2. N-нитрозоамины и другие побочные эффекты остаточного нитрита натрия в мясных продуктах 22
1.3. Превращения нитрита натрия в мясных продуктах
1.4. Механизм проявления нитритом натрия антимикробных свойств
1.5. Механизм проявления нитритом натрия антиокислительных свойств
1.6. Механизм образования окраски мясных продуктов 31
1.7. Механизм формирования органолептических свойств мясных продуктов 33
1.8. Способы снижения остаточного нитрита натрия. Бактериальная денитрификация 36
1.9. Применение микроорганизмов в производстве мясных продуктов. Staphylococcus carnosus и его генетический аппарат денитрификации 42
Глава 2. Методики постановки эксперимента и методы исследований 47
2.1. Схема постановки эксперимента. Характеристика объектов исследования 47
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Выделение плазмиды из грамотрицательных микроорганизмов 50
2.2.2. Выделение плазмиды из грамположительных микроорганизмов 51
2 2.3. Выделение хромосомной ДНК из прокариотических и эукариотических микроорганизмов 52
2. 2.4. Очистка плазмидной и хромосомной ДНК в градиенте хлористого цезия 53
2.2.5. Выделение фрагмента ДНК из легкоплавкой агарозы 54
2.2.6. Закладка штамма на хранение в глицерине 55
2.2.7. Приготовление компетентной культуры Е. coli для трансформации электропорацией 55
2.2.8. Электропорация Е. coli 56
2.2.9. Перенос по Саузерну 56
2.2.10. Гибридизация по Саузерну 58
2.2.11. Лигирование ДНК 59
2.2.12. Рестрикция ДНК 60
2.2.13. Щелочное дефосфорилирование ДНК 60
2.2.14. Полимеразная цепная реакция 61
2.2.15. Получение мутантных штаммов, дефектных по гену thy А 63
2 2 16 Приготовление компетентной культуры Staphylococcus carnosus для трансформации электропорацией 64
2.2.17. Электропорация компетентной культуры Staphylococcus carnosus 64
2.2.18. Определение содержания нитрита натрия в бактериальной среде и мясных продуктах 66
2.2.19. Определение степени окисления жира по пероксидному числу 67
2.2.20. Дистилляционный метод определения окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой 68
2.2.21. Определение кислотного числа 68
2.2.22. Определение содержания нитрозопигментов мясных продуктах 69
2.2.23. Оценка органолептических показателей 69
2.2.24. Оценка микробиологических показателей 70
2.2.25. Определение количества молочнокислых микроорганизмов 73
2.2.26. Определение влагосвязывающей способности мясопродуктов 74
2.2.27. Потенциометрический метод определения рН мясопродуктов 74
2.2.28. Определение массовой доли влаги 75
2.2.29. Определение массовой доли белка 75
2.2.30. Определение массовой доли жира 77
2.2.31. Определение массовой доли золы 77
2.2.32. Определение содержания хлорида натрия 78
2.2.33. Клинические испытания in vivo 79
Глава 3. Разработка систем селекции и экспрессии. Получение штамма-продуцента фермента нитритредуктазы 80
3.1. Выбор штамма для создания продуцента фермента нитритредуктазы 80
3.2. Конструирование термочувствительного вектора pBTmcs для грамположительных микроорганизмов 82
3.3. Получение штамма Staphylococcus carnosus (thyA~) 85
3.4. Получение в составе pUC 19 конструкций для замещения промотора нитритредуктазного оперона 86
3.4.1. Клонирование флангов для интеграции 86
3.4.2. Клонирование промоторов 88
3.4.3. Клонирование селективных маркеров 89
3.4.4. Получение промежуточных конструкций 92
3.4.5. Получение конечных конструкций 93
3.5. Введение в составе pBTmcs конструкций для замещения промотора нитритредуктазного оперона 95
3.6. Трансформация, получение интеграции плазмид для замещения промотора оперона nir и изучение нитритредуктазной активности клонов 96
3.7 Замена селективного маркера в pBT-dxyl-nirR 99
3.8. Замена промотора гена xylA в плазмиде рВТ 100
3-9. Трансформация, получение интеграции плазмиды pBT-thyA-gap-nirR и изучение нитритредуктазной активности клонов 100
Глава 4. Изучение нитритредуктазной активности штамма S. carnosus LIA -96
с использованием модельной фаршевой системы 103
Глава 5. Разработка бактериального препарата «Биоцвет» 106
Глава 6. Комплексное исследование вареных колбас, изготовленных с применением бактериального препарата «Биоцвет» 112
Социальные и экономические эффекты от использования бактериального препарата «Биоцвет» 119
Заключение по работе 120
Выводы 123
Список использованной литературы 125
Приложение 1 135
