СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Особенности структуры, свойства и применение коллагена 20
1. 2. Коллагеназы. 20
1.2.1. Общие сведения о протеолитических ферментах. 20
1.2.2. Коллагеназы и источники их получения. 21
1.2.2.1. Коллагеназы животных 22
1.2.2.2. Коллагеназы растений 26
1.2.2.3. Микробные коллагеназы 27
1.2.3. Скрининг и определение активности коллагеназ 30
1.2.4. Оптимизация условий получения микробных коллагеназ 32
1.2.5. Очистка и характеристика фермента 37
1.2.6. Особенности получения грибных коллагеназ 38
1.3. Использование коллагеназ в различных областях жизнедеятельности
человека 42
1.3. 1. Коллагеназы в медицине и фармации 42
1.3.2. Применение коллагеназ в пищевых отраслях 53
1.3.3. Применение коллагеназ в других областях 56
1.4. Способы хранения микроорганизмов 59
1.5. Заключение по обзору литературы 66
ГЛАВА 2.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследований 67
2.2. Поддержание культур микромицетов 67
2.3. Методы хранения микромицетов 67
2.3.1. Хранение на среде Чапека-Докса 67
2.3.2. Хранение на среде с индуктором (коллагеном) 67
2.3.3. Хранение под вазелиновым маслом 67
2.3.4. Криохранение при температуре жидкого азота (-1960С) 68
3
2.3.5. Лиофилизация 68
2.3.6. Определение жизнеспособности культур после хранения 69
2.4. Погруженное культивирование микромицетов 69
2.4.1. Культивирование в колбах на шейкере 70
2.4.1.1. Инокуляция спорами 70
2.4.1.2. Инокуляция вегетативным мицелием 70
2.4.2. Культивирование в ферментере 71
2.5. Твердофазное культивирование Aspergillus fumiganus 71
2.6. Определение протеолитической активности в культуральной жидкости72
2.7. Определение коллагенолитической активности 73
2.7.1. Оценка коллагенолитической активности микромицетов при
поверхностном культивировании 73
2.7.2. Определение коллагенолитической активности в фильтратах
культуральной жидкости и других растворах 74
2.8. Методы выделения и очистки коллагенолитических ферментов 75
2.8.1. Гель-фильтрация 75
2.8.2. Аффинная хроматография 75
2.9. Методы анализа полученных ферментных препаратов 76
2.9.1. Электрофорез в ПААГ 76
2.9.2. Определение оптимума рН и температуры ферментных препаратов 78
2.9.3. Ингибиторный анализ 79
2.10. Определение концентрации белка 79
2.11. Определение аминогрупп аминокислот 79
2.12. Определение сахаров антроновым методом 80
2.13. Статистическая обработка результатов 81
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3. ОТБОР МИКРОМИЦЕТОВ-ПРОДУЦЕНТОВ
КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕАЗ
3.1. Оценка коллагенолитической активности микромицетов при
поверхностном культивировании на средах с коллагеном 82
4
3.2. Выбор перспективных культур для дальнейшего изучения при
погруженном культивировании 88
3.3. Изучение секреции протеолитических и коллагенолитических ферментов
при глубинном культивировании микромицетов 89
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СЕКРЕЦИИ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕАЗ
ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ASPERGILLUS FUMIGATUS
4.1. Выявление факторов экзогенной регуляции, влияющих на секрецию
внеклеточных коллагенолитических протеаз 97
4.1.1. Влияние состава питательной среды 97
4.1.2. Влияние концентрации спор в посевном материале на секрецию
коллагенолитических протеаз 100
4.1.3. Зависимость коллагенолитической активности секретируемых
ферментов от числа пассажей микромицета на среде с индуктором
(коллагеном) 102
4.1.4. Влияние способа инокуляции на секрецию коллагенолитических
протеаз при глубинном культивировании A. fumigatus 106
4.2. Масштабирование процесса культивирования A. fumigatus 110
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СЕКРЕЦИИ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ПРОТЕАЗ
ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ASPERGILLUS FUMIGATUS
5.1. Разработка способа твердофазного культивирования микромицета 112
5.2. Влияние различных носителей и субстратов на секрецию
коллагенолитических протеаз 114
5.3. Сравнение коллагенолитической активности и продуктивности культуры
при SmF и SSF-ферментации 116
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ
КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ ASPERGILLUS FUMIGATUS
6.1. Разработка методов выделения и очистки коллагенолитических
ферментов из культуральной жидкости 117
6.2. Изучение физико-химических и биохимических свойств полученных
ферментных препаратов 120
5
ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ МЕТОДА ХРАНЕНИЯ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И
КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ
7.1. Хранение на среде Чапека-Докса под слоем минерального масла 123
7.2. Жизнеспособность A. fumigatus в процессе хранения при температуре
жидкого азота и после лиофилизации 126
7.3. Коллагенолитическая активность A. fumigatus после хранения при
температуре жидкого азота и после лиофилизации 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 128
ВЫВОДЫ 133
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 135
