Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Заболевания, включенные в панель 16
1.1.1. Муковисцидоз 17
1.1.2. Фенилкетонурия 24
1.1.3. Галактоземия 26
1.2. Классические методы молекулярной диагностики 29
1.2.1. Скринирующие методы ДНК-диагностики 30
1.2.1.1. Амплификация рефракторной мутационной системы 30
1.2.1.2. Аллель-специфическая гибридизация олигонуклеотидов 30
1.2.1.3. Лигирование олигонуклеотидных зондов 32
1.2.2. Сканирующие методы ДНК-диагностики 33
1.2.2.1. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма
1.2.2.2. Гетеродуплексный анализ 34
1.2.2.3. Температурный и денатурирующий градиентный гель- электрофорез
1.3. Методы, основанные на количественной ПЦР в реальном времени 36
1.4. Микроматричный анализ 38
1.5. Однонуклеотидное удлинение праймеров 40
1.6. Капиллярное секвенирование (секвенирование по Сенгеру) 41
1.7. Технологии МПС
1.7.1. Roche 454 Life Sciences 43
1.7.2. Ion Torrent 45
1.7.3. Illumina 48
1.8. Анализ данных высокопроизводительного секвенирования 50
1.8.1.Определение нуклеотидов (base calling) 51
1.8.2.Выравнивание прочтений (alignment) 53
1.8.3.Идентификация вариантов (variant calling) 55
1.8.4. Интерпретация результатов 57
1.8.5. Формы записи генетических вариантов 60
1.9. Высокопроизводительное секвенирование в клинической практике 62
1.10. Заключение 64
ГЛАВА 2. Материалы и методы 68
2.1. Дизайн панели 68
2.2. МПС-секвенирование 68
2.3. Секвенирование по Сенгеру 69
2.4. Биоинформатический анализ 70
2.5. Статистическая обработка данных 72
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Создание базы данных клинически-значимых генетических вариантов 73
3.2. Дизайн панели 77
3.3. Программное обеспечение VariFind
3.3.1. Общее описание 83
3.3.2. Контроль качества данных 84
3.4. Верификация путем секвенирования по Сенгеру 89
3.4.1. Протокол верификации путем секвенирования по Сенгеру 89
3.4.2. Результаты верификации путем секвенирования по Сенгеру 96
3.5. Клиническая валидация тест-системы 101
3.5.1. Протокол валидации 101
3.5.2. Результаты клинической валидации 106
3аключение 117
Выводы 119
Применение результатов и научных выводов 121
Список публикаций по теме диссертации 122
Список использованных сокращений 124
Благодарности
