Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Принципы иммунотерапии опухолей 11
1.1.1 Общие подходы и основания для иммунотерапии опухолей.. 11
1.1.2 Виды противоопухолевой терапии
1.1.2.1 Активная специфическая противоопухолевая терапия 12
1.1.2.2 Неспецифическая активная противоопухолевая терапия 13
1.1.2.3 Пассивная неспецифическая противоопухолевая терапия. ЛАК терапия 14
1.1.2.4 Пассивная специфическая противоопухолевая терапия 15
1.1.2.4.1 Терапия моноклональными антителами 15
1.1.2.4.2 Инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) 16
1.1.2.4.3 Терапия Т-лимфоцитами с химерным TCR рецептором... 17
1.2 Т-лимфоциты с химерными антигенными рецепторами 17
1.2.1 TCR-рецептор 17
1.2.2 Цитотоксическое действие Т-лимфоцитов 20
1.2.3 Подходы к построению химерного антигенного рецептора Т-лимфоцитов 22
1.2.4 Методы внесения генетического материала в Т-лимфоциты, для создания химерного антигенного рецептора 29
1.2.5 Антигены для химерных антигенных рецепторов 31
1.2.6 Проблемы и подходы клинического использования Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами 35
1.2.7 Клинические испытания Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами 38
1.3 Раково-эмбриональный антиген (РЭА) как объект терапии Т з
лимфоцитами с химерными антигенными рецепторами 40
1.3.1 Раково-эмбриональный антиген, структура и функции 40
1.3.2 Опыт применения Т-лимфоцитов с генно-инженерными рецепторами к раково-эмбриональному антигену 42
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Моноклональные антитела к РЭА антигену 47
2.2 Культивирование адгезивных культур клеток 48
2.3 Выделение и активация лимфоцитов человека 49
2.4 Анализ связывания моноклональных антител к РЭА с культурами клеток 49
2.5 Выделение РНК из клеток гибридом и получение кДНК 50
2.6 Синтез олигонуклеотидов 51
2.7 Получение плазмид, содержащих ген CAR первого поколения с распознающей частью 1С6 53
2.8 Получение плазмид, кодирующих CAR поколения «1 +» 54
2.9 Получение плазмид, содержащих ген CAR первого поколения, содержащего распознающие домены антитела ЗС1 54
2.10 Получение плазмид, кодирующих рецептор третьего поколения 55
2.11 Трансфекция клеток культуры НЕК293 55
2.12 Трансфекция Т-лимфоцитов человека 57
2.13 Определение -цепи Т-клеточного рецептора в трансфецированных клетках НЕК293 57
2.14 Анализ связывания рецепторов, экспрессируемых трансфецированными клетками НЕК293, с РЭА 58
2.15 Анализ экспрессии плазмидных генов в трансфецированных лимфоцитах 59
2.16 Анализ экспрессии цитокинов в активированных трансфецированных лимфоцитах 61
2.17 Исследование цитотоксичности трансфецированных лимфоцитов методом МТТ 62
2.18 Исследование цитотоксичности трансфецированных лимфоцитов окраской CFDA-SE/PI 63
2.19 Исследование цитотоксичности трансфецированных лимфоцитов
с помощью ЛДГ-теста 64
2.20 Исследование влияния трансфецированных лимфоцитов на клеточный рост 65
2.21 Выделение и трансфекция лимфоцитов мыши 66
2.22 Исследование фармакокинетики плазмиды pcI/3Cl-3g на лабораторных животных 67
2.23 Определение противоопухолевой цитотоксичности Т-лимфоцитов, трансфецированных плазмидой pcI/3Cl-3g, в отношении перевивной опухоли НСТ116 на бестимусных мышах 2.23.1 Введение опухолевых клеток НСТ116 68
2.23.2 Приготовление препаратов лимфоцитов для инъекций 68
2.23.3 Приготовление препарата для инфузии 69
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Выбор антитела для построения распознающей части искусственного Т-клеточного рецептора 70
3.2 Конструирование химерных антигенных рецепторов к РЭА... 72
3.3 Исследование правильности сборки и экспрессии химерного Т-клеточного рецептора 73
3.4 Анализ связывания трансфецированных клеток культуры НЕК293, с РЭА в растворе 75
3.5 Анализ экспрессии химерного гена Т-клеточного рецептора в трансфецированных лимфоцитах 76
3.6 Исследование продукции цитокинов трансфецированными лимфоцитами при активации их РЭА 78
3.7 Исследование специфической цитотоксичности трансфецированных химерным рецептором лимфоцитов с помощью окраски CFDA-SE/PI 79
3.8 Исследование специфической цитотоксичности лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами методом МТТ 81
3.9 Исследование специфической цитотоксичности лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами с использованием ЛДГ-теста 85
3.10 Исследование влияния трансфецированных лимфоцитов на рост клеток в культуре 87
3.11 Исследование противоопухолевой активности лимфоцитов, трансфецированных плазмидой pcI/3Cl-3g in vivo.. 92
3.12 Исследование фармакокинетики плазмиды pel/3 С1 - 3 g на
лабораторных животных 99
Заключение 103
Выводы 109
Список сокращений 111
Список литературы
