Введение
ГЛАВА 1. Роль точечных мутаций в патогенезе заболеваний человека и современные методы их детекции. (Литературный обзор) 10
1.1. Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека 10
1.1.1. Мутации в генах факторов II, V свертываемости крови, метилентетрагидро-фолатредуктазы человека и их связь с предрасположенностью к тромбозам и гипергомоцистеинемии 10
1.1.2. Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии 13
1.1.3. Мутации в генах рецептора витамина D3, al-коллагена типа 1, эстрогенового рецептора а человека и их связь с предрасположенностью к остеопорозу 17
1.2. Современные методы детекции точечных мутаций 21
1.2.1. Метод детекции точечных мутаций, основанный на удлинении праймера на один нуклеотид 22
1.2.1.1. Анализ точечных мутаций с помощью капиллярного электрофореза 26
1.2.1.2. Анализ точечных мутаций с помощью флуоресцентной поляризации 27
1.2.1.3. Анализ точечных мутаций с помощью масе-спектрометрии 28
1.2.2. Метод детекции точечных мутаций на основе полимеразной цепной реакции
с детекцией в режиме реального времени 29
1.2.3. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования 31
1.2.4. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов 33
1.2.5. Методы детекции точечных мутаций, основанные на анализе конформационного полиморфизма ДНК 36
1.2.5.1. Гетеродуплексный анализ 36
1.2.5.2. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечпых фрагментов
ДНК 37
1.2.6. Методы детекции точечных мутаций, основанные на использовании
эндонуклеаз 38
1.2.6.1. Аллель-специфический анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции. 38
1.2.6.2. Анализ с использованием эндонуклеаз, специфичных к неспаренным
нуклеотидам в ДНК 40
1.2.7. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической поли-
меразноЙ цепной реакции 41
1.3. Практическая реализация технологии детекции точечных мутаций 43
1.3.1. Наборы реагентов, основанные на удлинении праймера на один нуклеотид.... 43
1.3.2. Наборы реагентов, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией
в режиме реального времени 46
1.3.3. Наборы реагентов, основанные на использовании аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов 47
1.3.4. Наборы реагентов, основанные на использовании эндонуклеаз и ферментов репарации 48
1.3.5. Наборы реагентов, основанные на аллель-специфической полимеразной цепной реакции 51
ГЛАВА 2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДИК. (Обсуждение результатов) 55
2.1. Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом 63
2.2. Создание системы детекции мутаций в генах факторов И (G20210A), V
(G1691 А) свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т)
человека методом АС-ПЦР 65
2.2.1. Идентификация генотипов методом секвенирования 67
2.2.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР 69
2.2.3. Клонирование фрагментов геномной ДНК человека, содержащих области с предполагаемыми мутациями в генах факторов II (G20210A), V (G1691 А) свертываемости крови и метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) 75
2.3. Создание системы детекции полиморфизмов М235Т, Т174М и G(-6)A в гене ангиотензиноген а человека методом АС-ПЦР 77
2.3.1. Идентификация генотипов методом секвенирования 78
2.3.2. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР 82
2.4. Создание системы детекции нуклеотидных замен в генах аі-коллагена типа I (G2046T), рецептора витамина D3 (G45082A) и эстрогенового рецептора а
человека (Т938С и A984G) методом АС-ПЦР 89
2.4.1. Идентификация генотипов методом секвенирования 91
2.4.2. Идентификация полиморфизма G45082A в гене рецептора витамина D3 с помощью эндонуклеазы рестрикции Bsm I. 96
2.4.3. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР 97
2.5. Анализ продуктов АС-ПЦР с помощью автоматических анализаторов ДНК с флуоресцентной детекцией 101
2.5.1. Флуоресцентные красители, используемые для мечения ДНК 101
2.5.2. Известные системы для автоматического анализа ДНК с использованием
флуоресцентной детекции (приборы и используемые флуорофоры) 103
ф 2,5.3. Анализ мутаций в генах ангиотензиногена, факторов II и V свертываемости крови, метилентетрагидрофолатредуктазы, рецепторов витамина D3 и эстрогенового (а), а также а 1-коллагена типа I человека 106
2.6. Влияние способов выделения геномной ДНК на точность идентификации
мутаций ПО
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 113
3.1. Реактивы и материалы 113
3.2. Приборы и методы 114
3.3. Общие методики 115
3.3.1. Выделение ДНК с использованием протеиназы К и фенольной экстракции.... 115
3.3.2. Выделение ДНК с использованием набора реагентов DIAtom DNA PreplQO фирмы «Биоком» 116
3.3.3. Выделение ДНК с использованием набора реактивов фирмы «Мсдиген» 117
3.3.4. Выделение ДНК с использованием сорбента Chelex 100 118
3.3.5. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция П8
3.3.6. Электрофорез вагарозном геле 119
3.3.7. Электрофорез в поли акрилам идиом геле 119
3.3.8. Капиллярный электрофорез 119
3.3.9. Секвенирование ПЦР-фрагментов с использованием Р-меченых праймеров
поСэнгеру 120
3.3.10. Секвенирование ПЦР-фрагментов с использованием Су5-меченых терминаторов по Сэнгеру 121
3.3.11. Приготовление стандартов длины 122
3.3.12. Проведение ферментативных реакций 123
ф 3.3.13. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 123
3.3.14. Трансформация клеток Е. сої і и анализ клонов 123
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
