ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...........................................................................................................11
1.1 Острый миелоидный лейкоз: происхождение заболевания ..............................................11
1.1.1 Классификация острого миелоидного лейкоза................................................................13
1.1.2 Диагностика и терапия острого миелоидного лейкоза ...................................................16
1.1.3 Лекарственная устойчивость острого миелоидноо лейкоза...........................................20
1.1.4 Провоспалительное микроокружение при остром миелоидном лейкозе .....................24
1.2 Перспективы и проблемы применения препаратов на основе TRAIL в лечении
злокачественных новообразований ...........................................................................................26
1.2.1 Сигнальный путь TRAIL....................................................................................................26
1.2.2. Препараты на основе TRAIL............................................................................................29
1.3 Динамика проапоптотических TRAIL-рецепторов и устойчивость опухолевых клеток к
TRAIL-индуцированному апоптозу...........................................................................................31
1.3.1 Транскрипционная регуляция экспрессии DR4 и DR5...................................................31
1.3.2 Посттрансляционные модификации DR4 и DR5.............................................................32
1.3.3 Участие липидных рафтов в регуляции динамики проапоптотических TRAILрецепторов на внешней клеточной мембране...........................................................................36
1.3.4 Сенсибилизация клеток к TRAIL-индуцированной гибели с помощью индукции
экспрессии проапоптоических рецепторов DR4 и DR5...........................................................37
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................................................39
2.1 Материалы..............................................................................................................................39
2.2. Методы ..................................................................................................................................39
2.2.1 Клеточные культуры..........................................................................................................39
2.2.2 Протокол получения белка izTRAIL ................................................................................40
2.2.3 Анализ пролиферативной активности и ДНК-цитометрия ............................................40
2.2.4 Анализ коротких тандемных повторов (STR) .................................................................41
2.2.5 Секвенирование транскриптомов клеток.........................................................................41
2.2.6 Анализ дифференциальной экспрессии генов.................................................................41
2.2.7 Количественная ПЦР с обратной транскрипцией...........................................................42
2.2.8 Анализ жизнеспособности.................................................................................................43
2.2.9 Анализ морфологии клеток ...............................................................................................43
2.2.10 Анализ адгезии клеток .....................................................................................................44
2.2.11 Анализ фагоцитарной активности ..................................................................................44
3
2.2.12 Анализ окислительной активности, продукции NO, содержания митохондрий и
лизосом.........................................................................................................................................44
2.2.13 Иммунофенотипирование и анализ экспрессии рецепторов к TRAIL........................45
2.2.14 Иммунофлуоресцентный анализ продукции цитокинов ..............................................45
2.2.15 Статистическая обработка данных .................................................................................46
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................47
3.1 Получение клеток ОМЛ, способных к адгезии и распластыванию на ВКМ, в условиях
долговременной трехмерной суспензионной культуры высокой плотности........................47
3.2 Характеристика клеток ОМЛ, способных к адгезии и распластыванию на ВКМ,
полученных в условиях долговременной трехмерной суспензионной культуры высокой
плотности .....................................................................................................................................49
3.2.1 Молекулярно-генетическая идентификации клеток ТНР-1ad .......................................49
3.2.2 Морфологическая характеристика клеток THP-1ad .......................................................51
3.2.3 Исследование адгезии клеток THP-1ad к внеклеточному матриксу .............................53
3.2.4 Изучение пролиферативной активности клеток ТНР-1ad..............................................54
3.2.5 Иммунофенотипирование клеток ТНР-1ad......................................................................55
3.2.6 Исследование фагоцитарной активности клеток THP-1ad.............................................56
3.2.7 Оценка относительного размера и гранулярности цитоплазмы клеток THP-1ad........58
3.2.8 Анализ содержания митохондрий и лизосом в клетках THP-1ad..................................58
3.2.9 Исследование продукции АФК и оксида азота клетками THP-1ad...............................59
3.2.10 Анализ продукции цитокинов клетками THP-1ad ........................................................60
3.3 Исследование устойчивости макрофагоподобных клеток ОМЛ THP-1ad к TRAILиндуцированной гибели..............................................................................................................64
3.4 Изучение механизмов устойчивости макрофагоподобных клеток ОМЛ THP-1ad к
TRAIL-индуцированной гибели.................................................................................................66
3.4.1 Идентификация наиболее активированных сигнальных путей в макрофагоподобных
клетках THP-1ad ..........................................................................................................................66
3.4.2 Идентификация и функциональная аннотация дифференциально экспрессируемых
генов с наибольшим изменением экспрессии у макрофагоподобных клеток ТНР-1ad .......71
3.4.3 Анализ сетей взаимодействия продуктов ДЭГ и идентификация генов-концентраторов
у макрофагоподобных клеток ТНР-1ad.....................................................................................75
3.4.4 Анализ сетей взаимодействия продуктов идентифицированных генов-концентраторов
с представителями семейств IAP, BCL-2 и рецепторами к TRAIL ........................................77
3.5 Оценка возможности подавления устойчивости макрофагоподобных клеток ОМЛ ТНР1ad к TRAIL-индуцированной гибели.......................................................................................82
4
3.5.1 Анализ влияния ингибирования адгезии клеток ТНР-1ad на устойчивость к TRAILиндуцированной гибели..............................................................................................................82
3.5.2 Изучение влияния низкомолекулярных ингибиторов тирозин-специфичных
протеинкиназ, химиотерапевтических и противовоспалительных препаратов на
устойчивость клеток ТНР-1ad к TRAIL-индуцированной гибели..........................................82
3.5.3 Изучение влияния низкомолекулярных индукторов экспрессии проапоптотических
TRAIL рецепторов на устойчивость клеток ТНР-1ad к TRAIL-индуцированной гибели ...85
ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................88
ВЫВОДЫ .....................................................................................................................................91
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................92
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ............................120
БЛАГОДАРНОСТИ ..................................................................................................................123
