Оглавление
Список сокращений ........................................................................................................ 5
Введение ........................................................................................................................... 7
Глава 1. Обзор литературы. .......................................................................................... 10
1.1. Эукариотическая рибосома. ............................................................................... 10
1.1.1. Строение эукариотической рибосомы ....................................................... 10
1.2. Биогенез рибосом эукариот. ............................................................................... 12
1.2.1. Биогенез рибосом – общие положения ...................................................... 12
1.2.2. Транскрипция 47S рибосомной РНК полимеразой I ................................ 19
1.2.3. Посттранскрипционные модификации пре-рРНК .................................... 22
1.2.4. Процессинг пре-рРНК.................................................................................. 23
1.2.5. Созревание предшественников рибосом в ядрышке и нуклеоплазме .... 25
1.2.6. Финальные стадии созревания предшественников рибосом в цитоплазме
.................................................................................................................................. 31
1.3. Ранние факторы биогенеза рибосом RPF1 и ESF1. ......................................... 35
1.3.1. RPF1 – фактор биогенеза 60S субъединицы .............................................. 35
1.3.2. ESF1 – фактор биогенеза 40S субъединицы .............................................. 36
Заключение ..................................................................................................................... 37
Глава 2. Материалы и методы. ..................................................................................... 38
2.1. Материалы. .......................................................................................................... 38
2.1.1. Химические реактивы, буферные растворы и сопутствующие материалы
.................................................................................................................................. 38
2.2. Методы. ................................................................................................................ 40
2.2.1. Получение генетических конструкций ...................................................... 40
2.2.2. Культивирование клеток, трансфекция, получение лентивирусных
частиц и лентивирусная трансдукция .................................................................. 41
2.2.3. Выделение РНК из клеток и реакционных смесей ................................... 42
3
2.2.4. Конъюгирование тотальной РНК с биотин-азидом с помощью клик
реакции .................................................................................................................... 43
2.2.5. Электрофорез РНК в агазорном геле в денатурирующих условиях и
нозерн-блоттинг ...................................................................................................... 44
2.2.6. Анализ профиля предшественников рРНК ................................................ 44
2.2.7. Выделение белка из образцов клеток и фракций сахарозных градиентов,
электрофорез в денатурирующих условиях и вестерн-блоттинг ...................... 45
2.2.8. Синтез кДНК и ПЦР в реальном времени ................................................. 46
2.2.9. Иммуноцитохимия и конфокальная микроскопия .................................... 46
2.2.10. Выделение ядерных прерибосомных комплексов и их
центрифугирование в градиенте сахарозы .......................................................... 47
2.2.11. Профиль полисом ....................................................................................... 48
2.2.12. Обсчет изображений, полученных с помощью конфокальной
микроскопии ........................................................................................................... 48
2.2.13. Тест метаболической активности клеток с использованием аламарового
синего ....................................................................................................................... 49
2.2.14. Статистический анализ .............................................................................. 49
Глава 3. Результаты и их обсуждение .......................................................................... 50
Введение...................................................................................................................... 50
3.1. Нокдаун RPF1 или ESF1 не нарушает общую морфологию ядрышка, но
индуцирует накопление NPM1 в нуклеоплазме ..................................................... 51
3.2. Нокдаун белка RPF1 увеличивает содержание 5’ETS-содержащих
предшественников ..................................................................................................... 61
3.3. Нокдаун RPF1 преимущественно приводит к изменению профиля пре-рРНК
в биогенезе 60S субъединицы ................................................................................... 63
3.4. Нокдаун ESF1 вызывает изменения в профиле предшественников 18S рРНК
и ускорение пути биогенеза 2 ................................................................................... 67
3.5. Факторы биогенеза рибосом RPF1 и ESF1 ко-седиментируют с
предшественниками 60S и 40S субъединиц, соответственно ............................... 69
4
3.6. Нокдаун факторов биогенеза рибосом RPF1 и ESF1 не приводит к
заметному изменению профиля полисом в клетках ............................................... 71
3.7. Обсуждение результатов .................................................................................... 74
Выводы ........................................................................................................................... 80
Список литературы ........................................................................................................ 81
