Введение
1. Импорт тРНК в митохондрии 9
1.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших 10
1.1.1. Импорт тРНК в митохондрии Tetrahymena 10
1.1.2. Импорт тРНК в митохондрии трипаносоматид 12
1.1.2.1. Отряд Kinetoplastidae 12
1.1.2.2. Отряд Leishmania 14
1.1.3. Другие представители простейших 19
1.2. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей 19
1.3. Импорт тРНК в митохондрии растений. 25
1.4. Импорт тРНК в митохондрии животных 28
2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков 30
2.1 Введение 30
2.2. Функции УПС в клетке 31
2.3. Убиквитинилирующая система в S. cerevisiae 32
2.4. 26S протеасома: строение и функционирование 35
2.4.1.20S субчастица, или каталитическое ядро 36
2.4.2. 19S регуляторная субчастица 39
2.5.Где локализованы протеасомы в клетке? 40
2.6. Узнавание полиубиквитиновых цепей 41
2.6. Протеасомиые субъединицы, узнающие пояиубиквитиновые цепи 41
2.6.2. ЕЗ и Е4 ферменты в направлении субстратов к протеасоме 42
2.6.3. Доставка субстратов к протеасоме посредством Cdc48 и его кофакторов43
2.6.4. Шапероны и их кофакторы в деградации белков 45
2.7. UFD путь 46
2.8. Непротеолитическая роль убиквитииа и убиквитин-связывающих белков в клетке 48
2.8.1. Образование моноубиквитинилированных белков 49
2.8.2. Связывание моноубиквитииилированных белков с различными убиквиган-связывающими доменами 49
2.8.3. Альтернативные функции убиквитииа 50
2.9. Индукция УПС и каскадов протеинкиназ в ответ на тепловой шок 54
3. Енолаза - гликолитический фермент 56
2 Материалы и методы исследования 61
1. Штаммы микроорганизмов и линии клеток 64
1.1. Штаммы Escherichia coli 64
1.2. Штаммы Saccharomyces cerevisiae 64
1.3. Линия клеток человека 66
2. Условия выращивания организмов 66
3. Генно-инженерные конструкции 61
4. Генно-инженерные методы 70
4.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 70
4.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование 71
4.3. Лигирование 71
4.4. Обратная транскрипция и амплификация 71
5. Определение пуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера 71
6. Трансформация клеток E.coli 72
7. Трансформация Saccharomyces cerevisiae плазмидной ДНК 73
8. Трансформация Saccharomyces cerevisiae библиотекой кДНК 74
9. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae 74
10. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток 75
11. Определение активности р-галактозидазы 75
11.1. Определение активности р-галактозидазы с помощью иммобилизации клеток на нитроцеллюлозных фильтрах 75
11.2. Определение активности р-галактозидазы с использованием раствора X-gal в 0.5% агаре 75
12. Скрещивание дрожжей 76
13. Выделение ДНК из клеток дрожжей 76
14. Выделение митохондриальных РНК из дрожжей 76
14.1.Выделение митохондрий 76
14.2. Выделение митохондриальных РНК 77
15. Выделение суммарных клеточных РНК из дрожжей 78
16. Гибридизация по Нозерну. 78
17. Western-гибридизация 79
18. Мечение тРНК для реакций импорта 80
19. Проверка амноацилирования РНК методом перйодатного окисления и мечения с использованием РНК-лигазы 81
20. Транспорт радиоактивно меченной ТРК1 в изолированные митохондрии 82
20.1. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей 82
20.2. Выделение митохондрий из клеток дрожжей 83
20.3. Исследование импорта РНК в изолированные митохондрии 83
21. Выделение митохондрий из клеток человека 84
22. Выделение митохондрий из гепатоцитов быка 84
23. Измерение активности протеасомы in vitro 85
24. Локализация митохондриальных белков 85
24.1. Получение 355-меченных белков 86
24.2. Импорт "Э-меченных белков в изолированные митохондрии дрожжей 86
25. Локализация 358-меченых еполаз в митохондриальной фракции дрожжей 86
26. Конфокальная микроскопия клеток дрожжей 87
27. Определение энзиматической активности гликолитических ферментов 87
28. Выделение фракции, обогащенной внешними мембранами митохондрий дрожжей 91
29. Двумерный натжпый электрофорез по Шагеру и фон Ягову 92
29.4. Western-гибридизация BN-PAGE 93
30. Иымунопреципигация 93
31. Методы масс-спектрометрического анализа 94
З1.1. Визуализация белков в ПЛАГ 94
31.2. Расщепление белков трипсином в геле 94
31.3. MALDI- TOFанализ 95
3 Результаты и обсуждение 96
1. Поиск потенциальных факторов импорта тРНК с использованием дву тригибридных систем в дрожжах 96
1.1. Поиск белков, взаимодействующих с pre-Msklp в двугибридиой системе 96
1.1.1. Метод двугибридиой системы в дрожжах 96
1.1.2. Скрининг библиотек кДНК для поиска белков, связывающих pre-Msklp 98
1.2. Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК 101
1.3. Функциональный анализ роли потенциальных факторов импорта 108
1.3.1. Роль убиквитин-протеасомной системы в импорте тРНК 113
1.3.2. Анализ роли других потенциальных факторов импорта 129
2. Новые функции енолазы как фактора импорта тРНК 141
2.1. Анализ локализации енолазы в клетках дрожжей in vivo с использованием Western-гибридизации 144
2.2. Локализация Епо2р, меченной YFP, в клетках дрожжей 147
2.3. Енолаза, связанная с митохондриями, является функционально активной 149
3. Анализ митохондриалышх комплексов, содержащих енолазу 151
Выводы 167
