Введение
1. Литературный обзор 13
1.1 Пути везикулярного транспорта в клетке 13
1.1.1 Антероградный путь 14
1.1.2 Ретроградный (эндоцитозный) путь 17
1.2 Общие принципы организации эндоцитозного пути 23
1.2.1 Основные компартменты эндоцитозного пути и гипотезы его организации 23
1.2.3 Регуляция эндоцитоза компонентами цитоскелета 26
1.2.2 Малые ГТФазы Rab как основные регуляторные компоненты эндоцитозного пути 33
1.3.2 Механизмы слияния эндосом 35
1.3 Ранние эндосомы: функции, биогенез, молекулярные маркеры 38
1.3.1 Ранняя эндосома как компартмент для сортировки поступающих в клетку грузов 38
1.3.2 Малая ГТФаза Rab5 и ее эффектор EEA1 как маркеры РЭ. Современные представления о биогенезе ранних эндосом 40
1.4. Механизмы созревания поздних эндосом 46
1.4.1 Механизмы сортировки груза во внутренние пузырьки мультивезикулярных тел. Роль ESCRT- комплексов. 46
1.4.2 Механизмы Rab5-Rab7 конверсии
1.5 Деградация компонентов клетки путем аутофагии. Взаимодействие аутофагии и эндоцитозного пути 50
1.6 Эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста как модель для изучения механизмов рецепторо-опосредованного эндоцитоза 52
2. Материалы и методы исследования 55
2.1 Культивирование клеток 55
2.2 Лиганды и их производные 55
2.3 Стимуляция эндоцитоза 56
2.4 Плазмидные конструкции и трансфекция 56
2.5 Мечение плазматической мембраны липидом DPPE 57
2.6. Обработка клеток ингибиторами 57
2.7 Электрофорез и иммуноблоттинг 58
2.7.1 Приготовление проб для электрофоретического разделения 58
2.7.2 Электрофорез белков в полиакриламидном геле 59
2.7.4 Иммуноблоттинг 59
2.8 Двойное непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание клеток
2.9 Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 61
2.10 Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP) 62
2.11 Анализ и обработка изображений 63
2.12 Статистическая обработка данных 65
3. Результаты 66
3.1 Количество белка EEA1 в мембранной фракции клеток не изменяется при стимуляции в клетках эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов 66
3.2 Исследование динамики ассоциации белка EEA1 с мембранами везикул в клетках, стимулированных и нестимулированных добавлением ЭФР 69
3.3 Изучение взаимодействия EEA1- и ЭФР-положительных везикул методом прижизненной съемки 74
3.4 Изучение механизмов сегрегации EEA1- и ЭФР-положительных везикул 77
3.5 Анализ сегрегации EEA1- и ЭФР-положительных везикул с точки зрения процесса Rab5-Rab7 конверсии 81
3.6 EEA1-везикулы, выявляющиеся в подверженных сывороточному голоданию клетках, не являются аутофагосомами 86
3.7 Роль эндоцитозного пути в происхождении EEA1-положительных везикул 89
3.8 Роль биосинтетического пути в биогенезе EEA1-положительных везикул 92
4. Обсуждение 97
Заключение 109
Выводы 110
Список цитированной литературы 111
