Введение
2. Обзор литературы 16
2.1 Общие представления о нервно-мышечном синапсе 16
2.2 Синаптическая везикула и общие понятия о пулах везикул 19
2.3 Активные зоны (АЗ) двигательных нервных окончаний 23
2.4 Молекулярный механизм экзоцитоза
2.4.1 Кратко о сцеплении и докировании 26
2.4.2 Прайминг и SNARE-комплекс 27
2.4.3 Кальциевые сенсоры экзоцитоза 32
2.4.4 Шапероны и экзоцитоз. Разборка SNARE комплекса 35
2.5 Эндоцитоз синаптических везикул 37
2.5.1. Кратко о механизмах клатрин-опосредованного эндоцитоза 40
2.6 Мембранный холестерин и представления о рафтах 51
2.6.1 Специализированные варианты рафтов - кавеолы 56
2.7. Метаболизм холестерина в нервной системе 59
2.7.1 Общие сведения об источниках мозгового холестерина 59
2.7.2 Регуляция синтеза холестерина 60
2.7.3 Депонирование, эфиры холестерина 64
2.7.4 Межклеточный транспорт холестерина 65
2.7.5 Экскреция холестерина из мозга. Оксистеролы 66
2.8 Холестерин и липидные плотики в регуляции cинаптической передачи 70
2.8.1 Пресинаптические механизмы и холестерин 70
2.8.2 Постсинаптические процессы и холестерин 73
3. Методы исследования 80
3.1 Объект, растворы и реагенты 80
3.2 Электрофизиологические подходы 82
3.3. Флуоресцентные подходы 84
3.3.1 Слежение за везикулярными процессами: эндоцитозные FM-красители 84
3.3.2 Цитозольный уровень кальция 89
3.3.3 Внеклеточный уровень ацетилхолина 89
3.3.4 Внеклеточной уровень пероксида водорода 90
3.3.5 Оценка количества окисленного холестерин оксидазой холестерина 90
3.3.6 Внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК) 91
3.3.7 Оценка перекисного окисления липидов 91
3.3.8 Оценка внутриклеточного рН 92
3.3.9 Идентификация холестерина в мембранах
3.3.10 Маркирование скоплений ганглиозидов GM1 93
3.3.11 Оценка фазовых свойств мембраны 94
3.3.12 Маркирование никотиновых ацетилхолиновых рецепторов 95
3.3.14 Иммунофлюоресцения 95
3.4 Статистическая обработка данных 96
4. Результаты и их обсуждение 97
4.1 Холестерин и липидные плотики в нервно-мышечных синапсах 97
4.1.1 Локализация холестерина в синаптических мембранах 97
4.1.2 Идентификация липидных рафтов в синаптических мембранах 99
4.1.3 Распределение липидных рафтов и синаптических везикул в нервных окончаниях 102
4.1.4 Распределение липидных рафтов и постсинаптических никотиновых ацетилхолиновых рецепторов 106
4.1.5 Метил--циклодекстрин (МЦД) как инструмент для исследования значения мембранного холестерина и липидных плотиков 108 4.1.6 Возможная роль сосредоточения холестерина и липидных плотиков в нервно мышечных синапсах 112
4.2 Роль холестерина в вызванном экзоцитозе синаптических везикул и их
рециклировании в нервно-мышечном синапсе лягушки 115
4.2.1 Влияние 1мМ МЦД на спонтанную и вызванную одиночными потенциалами действия секрецию 115
4.2.2 Эффекты МЦД на кинетику освобождения медиатора при длительном высокочастотном раздражении 117
4.2.3 Эффекты 1 мМ МЦД на эндоцитоз и экзоцитоз синаптических везикул 120
4.2.4 Скорость везикулярного цикла и мембранный холестерин 125
4.2.5 Роль пресинаптического и везикулярного холестерина в экзо- и эндоцитозе везикул в двигательном нервном окончании 125
4.3 Механизмы участия холестерина в контроле спонтанного экзоцитоза в нервно мышечном синапсе лягушки 129
4.3.1 МЦД (10 мМ) усиливает спонтанную секрецию медиатора и экзоцитоз синаптических везикул 130
4.3.2 Истощение холестерина усиливает продукцию активных форм кислорода (АФК) во внутри- и внеклеточной среде, вызывая перекисное окисление липидов в синаптическом регионе 131
4.3.3 АФК вовлечены в вызванное удалением холестерина усиление спонтанного освобождения медиатора и экзоцитоза 135
4.3.4 АФК-зависимое увеличение внутриклеточной концентрацию Са2+ под действием МЦД: источники Са2+ 136
4.3.5 Иммунофлуоресцентное мечение TRPV1-каналов в синаптическом регионе 139
4.3.6 Повышение внутриклеточного Са2+ опосредует эффекты МЦД на освобождение медиатора и экзоцитоз 140
4.3.7 Са2+ зависимое-дефосфорилирование участвует в эффектах истощения мембранного холестерина на спонтанное освобождение и экзоцитоз 141
4.3.8 Роль протеинкиназы С в индуцированном удалением мембранного холестерина экзоцитозе 143
4.3.9 Механизм холестерин-зависимого контроля спонтанного экзоцитоза синаптических везикул 149
4.4 Холестерин и невезикулярное освобождение нейромедиатора в нервно-мышечном синапсе крысы. Связь невезикулярного освобождения с процессами экзо- и эндоцитоза 158
4.4.1 Влияние 1 мМ МЦД на спонтанное освобождение и вызванную секрецию медиатора при редкой и высокочастотной стимуляции 158
4.4.2 Протекание эндо- и экзоцитоза синаптических везикул после частичного удаления мембранного холестерина 161
4.4.3 Изменение Н-эффекта (показатель невезикулярного освобождения) под действием МЦД в покое и при ритмической стимуляции двигательного нерва 164
4.4.4 Н-эффект в условиях ингибирования везикулярного транспортера ацетилхолина везамиколом 167
4.4.5 Влияние МЦД на цитоплазматический рН в синаптическом регионе 169
4.4.6 Эффект уменьшения внутриклеточного рН на Н-эффект 171
4.4.7 Эффекты МЦД, стимуляции и везамикола на внеклеточный уровень ацетилхолина 172
4.4.8 Значение холестерина в невезикулярном освобождении медиатора. Связь неквантового освобождения и рециклирования синаптических везикул 176
4.5 Влияние ферментативного окисления холестерина на везикулярный цикл в нервно мышечных синапсах лягушки 182
4.5.1 Холестерин оксидаза эффективно окисляет холестерин мембран в нервно-мышечном препарате и снижает стабильность липидных рафтов 183
4.5.2 Влияние окисления холестерина на спонтанное и вызванное освобождение нейромедиатора 186
4.5.3 Эффекты холестерин оксидазы на эндо- и экзоцитоз синаптических везикул 188
4.5.4 Рециклирующий пул везикул и окисление мембранного холестерина 192
4.5.5 Влияние окисления холестерина на этапы везикулярного цикла в нервно мышечном синапсе. Возможные механизмы 194
4.6 Влияние оксистерола, 5-холестан-3-она, на экзо-эндоцитозный цикл синаптических везикул в нервно-мышечном синапсе мыши 200
4.6.1 5-Холестан-3-он изменяет свойства синаптических мембран 201
4.6.2 5-Холестан-3-он подавляет освобождение нейромедиатора при низкой и высокой частоте стимуляции, не влияя на спонтанное освобождение 204
4.6.3 5-Холестан-3-он снижает интенсивность эндоцитоза синаптических везикул, вызванного высокочастотной стимуляцией 207
4.6.4 5-Холестан-3-он ослабляет экзоцитоз синаптических везикул при высокочастотной стимуляции 211
4.6.5 5-Холестан-3-он не изменяет время рециклирования синаптических везикул 213
4.6.6 Эффекты 5-холестан-3-она на свойства мембран и экзоцитоз зависят от исходного уровня холестерина в плазматических мембранах 214
4.6.7 Возможные механизмы влияния 5-холестан-3-она на цикл синаптических везикул и состояние синаптических мембран
5. Заключение 225
6. Выводы 230
7. Список сокращений 232
8. Список литературы 233
