Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Особенности серного метаболизма у бактерий Sphaerotilus natans .12
1.2. Регуляторные аспекты функционирования сукцинатдегидрогеназной ферментной системы 16
1.3. Физико-химические характеристики и регуляция изоцитратлиазы – маркерного энзима глиоксилатного цикла .29
1.4. Функции аконитатгидратазы и особенности ее регуляции .36
1.5. Молекулярные аспекты функционирования ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла .43
Глава 2. Экспериментальная часть 51
2.1. Объекты и методы исследования 51
2.1.1. Объекты исследования .51
2.1.2. Состав питательных сред .51
2.1.3. Микроаэробное культивирование 52
2.1.2. Методы исследований 53
2.1.2.1. Получение клеточной суспензии и ферментных препаратов 53
2.1.2.2. Методы определения активности ферментов серного метаболизма 53
2.1.2.3. Анализ неорганических соединений серы 54
2.1.2.4. Определение активности ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла 54
2.1.2.4.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы 54
2.1.2.4.2. Определение активности аконитатгидратазы 55
2.1.2.4.3. Определение активности изоцитратлиазы 55
2.1.2.5. Определение количества белка 56
2.1.2.6. Проведение электрофоретических исследований 56
2.1.2.6.1. Аналитический электрофорез з
2.1.2.6.2. Специфическое проявление сукцинатдегидрогеназы, изоцитратлиазы и аконитатгидратазы 57
2.1.2.7. Методика получения высокоочищенных препаратов изоформ аконитатгидратазы и сукцинатдегидрогеназы 59
2.1.2.7.1. Очистка аконитатгидратазы 60
2.1.2.7.2. Разделение и очистка изоформ сукцинатдегидрогеназы 60
2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности изоформ ферментов 61
2.1.2.9. Молекулярно-биологические методы идентификации генов и исследование их экспрессии (СДГ, АГ и ИЦЛ) 61
2.1.2.9.1.Выделение суммарной клеточной РНК 61
2.1.2.9.2.Определение концентрации суммарной клеточной РНК 62
2.1.2.9.3.Получение кДНК методом обратной транскрипции 62
2.1.2.9.4.Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 63
2.1.2.9.5.Подбор специфических праймеров 63
2.1.2.9.6.Проведение ПЦР в реальном времени 64
2.1.2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных 64
2.3.Полученные результаты и их обсуждение 66
2.3.1. Трансформация серного метаболизма у штаммов S. natans subsp. sulfidivorans Д-501 и Д-507 при разных условиях культивирования 66
2.3.1.1. Влияние аэробного режима культивирования бактерий штамма Д-501 на скорость и продукты окисления тиосульфата 66
2.3.1.2. Анализ особенностей серного метаболизма штамма Д-507 Sphaerotilus natans при разных условиях питания 68
2.3.2. Особенности динамики активности ферментов серного
метаболизма у бактерий в разных условиях культивирования 69
2.3.3. Активность ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у штаммов Sphaerotilus natans subsp. sulfidivorans при разных условиях культивирования 72
2.3.3.1. Изменение активности ферментов ЦТК и ГЦ у штамма Д-501 73
2.3.3.2. Активность ключевых ферментов ЦТК и ГЦ в бактериях штамма Д-507 77
2.3.3.3. Активность сукцинатдегидрогеназы, изоцитратлиазы и аконитатгидратазы в бактериях штамма Д-380 81
2.3.4. Изоферментный состав ключевых ферментов ЦТК и ГЦ в штамме Д-501 83
2.3.4.1. Изоферментный состав СДГ в штамме Д-501 .83
2.3.4.2. Изоферментный состав АГ в штамме Д-501 85
2.3.4.3. Изоферментный состав ИЦЛ в штамме Д-501 86
2.3.4.4. Изоферментный состав СДГ в бактериях штамма Д-507 .88
2.3.4.5. Изоферментный состав аконитатгидратазы 90
2.3.4.6. Изоферментный состав изоцитратлиазы .91
2.3.4.7. Изоферментный состав сукцинатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и изоцитратлиазы у бактерий штамма Д-380 92
2.3.5. Разделение изоформ сукцинатдегидрогеназы и аконитатгидратазы с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Sephacel и исследование их кинетических характеристик 94
2.3.5.1. Использование ДЭАЭ-Sephacel для разделения изоформ сукцинатдегидрогеназы 95
2.3.5.2. Разделение изоформ аконитатгидратазы с помощью ионообменной хроматографии .98
2.3.5.3. Исследование некоторых регуляторных характеристик изоформ СДГ из бактерий штаммов Д-501 и Д-507 101
2.3.6. Экспрессия генов исследуемых ферментов ЦТК и ГЦ у бактерий разных штаммов S.natans при изменении условий
культивирования 105 2.3.6.1. Экспрессия генов изоцитратлиазы, аконитатгидратазы и сукцинатдегидрогеназы S.natans, штамм Д-501 при изменении аэробного режима культивирования .105
2.3.6.2. Идентификация генов, кодирующих изоферменты ключевых энзимов ЦТК и ГЦ в бактериях штамма Д-507 S. natans при разных условиях питания .108
2.3.6.3. Экспрессия изучаемых генов в бактериях штамма Д-380 при хемогетеротрофном типе питания 110
2.3.7. Синтез полигидроксибутиратов (PHB) .111
Заключение 113
Выводы 119
Список использованных источников
