Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современные представления о роли редокс-баланса, окислительной модификации белков и их деградации в дизрегуляции апоптоза при опухолевом росте 15
1.1 Современные представления о молекулярных механизмах реализации апоптоза при опухолевом росте 15
1.1.1 Молекулярные особенности реализации программированной гибели клетки по рецепторному пути 16
1.1.2 Молекулярные особенности реализации программированной гибели клетки по митохондриальному пути 21
1.2 Современные представления о молекулярных механизмах формирования окислительного стресса в клетке при опухолевом росте 25
1.2.1 Роль активных форм кислорода в развитии окислительного стресса 26
1.2.2 Молекулярные механизмы окислительной модификации белков, их деградации и рефолдинга при окислительном стрессе 29
1.2.3 Состояние тиолдисульфидной системы при окислительном стрессе 37
1.3 Окислительный стресс и программированная гибель клеток в патогенезе опухолевого роста 42
1.3.1 Роль активных форм кислорода в дизрегуляции апоптоза 43
1.3.2 Окислительная модификация белков, их деградация и тиолдисульфидная система в дизрегуляции программированной гибели клетки 48
Глава 2. Материал и методы исследования 55
2.1 Материал исследования 55
2.1.1 Культивирование опухолевых клеток линии Jurkat 56
2.1.2 Выделение мононуклеарных лейкоцитов 57
2.1.3 Выделение лимфоцитов крови из мононуклеарной фракции 57
2.1.4 Определение количества CD5-презентирующих лимфоцитов крови з
2.1.5 Моделирование экспериментальных процессов в опухолевых клетках линии Jurkat и лимфоцитах крови 59
2.1.6 Приготовление лизатов лимфоцитов крови и опухолевых клеток линии Jurkat 65
2.2 Методы исследования 66
2.2.1 Оценка реализации апоптоза 66
2.2.2 Определение количества TNF RI-презентирующих клеток 68
2.2.3 Определение количества Fas-презентирующих клеток 69
2.2.4 Оценка митохондриального потенциала 71
2.2.5 Определение содержания Hsp27, Hsp70, убиквитина, убиквитинлигазы и транскрипционных факторов NF-B, Apaf-1 72
2.2.6 Определение активности каспазы-3 74
2.2.7 Определение концентрации активных форм кислорода 75
2.2.8 Оценка продукции гидроксильного радикала 76
2.2.9 Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона
2.2.10 Определение концентрации SH-групп белков 78
2.2.11 Определение содержания белково-связанного глутатиона 79
2.2.12 Определение активности глутатионредуктазы 79
2.2.13 Определение активности тиоредоксинредуктазы 80
2.2.14 Определение активности глутатионпероксидазы 80
2.2.15 Определение содержания карбонильных производных белков 81
2.2.16 Определение содержания битирозина и окисленного триптофана 83
2.2.17 Оценка уровня экспрессии мРНК гена убиквитина 84
2.2.18 Определение концентрации общего белка 88
2.2.19 Статистическая обработка результатов исследования 88
Глава 3. Результаты собственных исследований 90
3.1 Моделирование окислительного стресса in vitro в лимфоцитах крови 90
3.2 Параметры реализации и регуляции апоптоза в опухолевых клетках линии Jurkat и лимфоцитах крови 92
3.3 Параметры реализации и регуляции апоптоза в опухолевых клетках линии Jurkat при различных условиях культивирования 98
3.4 Оценка окислительного стресса в опухолевых клетках линии Jurkat и лимфоцитах крови 110
3.5 Оценка окислительного стресса в опухолевых клетках линии Jurkat при различных условиях культивирования 111
3.6 Состояние тиолдисульфидной системы в опухолевых клетках линии Jurkat и лимфоцитах крови 114
3.7 Состояние тиолдисульфидной системы в опухолевых клетках линии Jurkat при различных условиях культивирования 117
3.8 Оценка окислительной модификации белков в опухолевых клетках линии Jurkat и лимфоцитах крови 123
3.9 Оценка окислительной модификации белков в опухолевых клетках линии Jurkat при различных условиях культивирования 125
3.10 Оценка убиквитин-зависимой деградации белков в опухолевых клетках линии Jurkat и лимфоцитах крови 131
3.11 Оценка убиквитин-зависимой деградации белков в опухолевых клетках линии Jurkat при различных условиях культивирования 133
Глава 4. Обсуждение результатов 138
4.1 Участие активных форм кислорода в регуляции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat и лимфоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro 138
4.2 Роль компонентов тиолдисульфидной системы, окислительной модификации белков и убиквитин-зависимой деградации в дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat 156
Заключение 171
Выводы 178
Список использованных сокращений 180
Список литературы 185
