Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Убиквитин-протеасомная система деградации белков 8
1.1.1. Система убиквитинирования белков 8
1.1.2. Строение протеасомы 11
1.1.3. Механизм взаимодействия протеасомы с субстратом 15
1.1.4. Деградация белков 20S протеасомой 17
1.1.5. Альтернативные регуляторы 20S протеасомы 18
1.1.6. Химическое ингибирование протеасомы 20
1.2. Регуляция экспрессии протеасомных генов 24
1.2.1. Факторы транскрипции, регулирующие экспрессию протеасомных генов в норме и при стрессе 24
1.2.2. Фактор транскрипции Rpn4 26
1.3. Клеточный ответ на повреждение ДНК 32
1.3.1. Источники повреждений ДНК в клетке 32
1.3.2. Клеточный ответ на повреждение ДНК 34
1.3.3. Убиквитин-протеасомная система в ответе на ДНК-повреждающий стресс 39
2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Материалы 42
2.1.1. Реактивы 42
2.1.2. Растворы 43
2.1.3. Культуральные среды 43
2.1.4. Ферменты 44
2.1.5. Наборы 44
2.1.6. Бактериальные штаммы 44
2.1.7. Дрожжевые штаммы 44
2.1.8. Плазмиды 45
2.1.9. Олигонуклеотиды 46
2.2. Методы 51
2.2.1. Молекулярное клонирование 51
2.2.2. Трансформация клеток S. cerevisiae 51
2.2.3. Метод выращивания серийных разведений дрожжевой культуры на чашках Петри (определение устойчивости клеток к стрессу) 52
2.2.4. Выделение РНК из клеток S. cerevisia e 52
2.2.5. Измерение относительного уровня мРНК генов 53
2.2.6. Выделение геномной ДНК S. cerevisiae 53
2.2.7. DamID 54
2.2.8. Измерение активности -галактозидазы 54
2.2.9. Измерение активности протеасомы 55
2.2.10. Вестерн-блот анализ клеточных лизатов 55
2.2.11. Определение активности систем репарации двухцепочечных разрывов 56
3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Разработка метода детекции привлечения Rpn4 к ДНК при помощи dam-метилазы
E.coli 57
3.1.1. Конструирование плазмид, кодирующих метилазу dam и гибридные белки, слитые с ней 58
3.1.2. Подбор условий рестрикции ДНК, выбор контролей и анализ привлечения Rpn4 к промоторным областям генов 60
3.2. Конструирование и исследование штамма с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией протеасомы 63
3.2.1. Конструирование штамма с мутацией PACE в промоторе гена PRE1 63
3.2.2. Исследование влияния нарушения регуляции гена одной из субъединиц на активность 20S протеасомы 65
3.2.3. Оценка влияния ингибирования протеолитической функции протеасомы на устойчивость клеток дрожжей к генотоксическому стрессу 67
3.2.4. Исследование стабильности Rpn4 и экспрессии его мишеней в штамме с нарушенной активностью протеасомы 70
3.3. Идентификация мишеней Rpn4, участвующих в ответе на ДНК-повреждающий стресс 73
3.3.1. Поиск мишеней Rpn4, участвующих в ответе на ДНК-повреждающий стресс 73
3.3.2. Исследование вклада Rpn4 в регуляцию генов MAG1-DDI1 и RAD52 75
3.3.3. Определение вклада Rpn4 в регуляцию других генов стрессового ответа 79
3.4. Конструирование и характеристика штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов, кодирующих белки системы репарации 82
3.4.1. Конструирование штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1-DDI1, RA D23 и RAD52 82
3.4.2. Характеристика устойчивости штаммов с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией генов MAG1-DDI1, RAD23 и RAD52 к генотоксическому стрессу 85
3.5. Обсуждение результатов 87
4. Выводы 91
5. Список сокращений 92
6. Список литературы 93
