Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1. Морфология основных структурных элементов рибосомы 11
2. Структурные домены 50S субчастицы рибосомы 17
3. Структурные домены 30S рибосомной субчастицы 20
4. Элонгационный цикл и различные конформационные состояния рибосомы 4.1. Межсубъединичные мостики 27
4.2. Функциональные центры рибосомы
4.2.1. Центр декодирования 31
4.2.2. Пептидилтрансферазный центр 36
4.2.3. Центр, ассоциированный с ГТФ-азной активностью факторов элонгации 38
4.3. Транслокация 48
4.3.1. Интермедиатные состояния рибосомы и взаимодействие EF-G с рибосомой 51
4.3.2. Вклад гидролиза ГТФ на факторах элонгации в формирование транслокацинных интермедиатов рибосомы 63
4.3.3. Подвижность структурных элементов рибосомы при EF-G-зависимой транслокации 66
4.3.4. Обратная транслокация 71
4.4. Подвижность L1-выступа и его роль в функционировании рибосомы 73
4.4.1. Роль L1-выступа в транслокации 75
4.4.2. Характеристика рибосомного белка L1 и его взаимодействий с РНК 79
4.4.3. Взаимодействие L1-выступа с фактором элонгации Р 84
Заключение 85
ГЛАВА II. Результаты и их обсуждение 87
1. Взаимодействие рибосомного белка S8 с рРНК 88
1.1. Кристаллическая структура изолированного рибосомного белка S8 88
1.2. Выбор минимального участка специфического связывания S8 на 16S рРНК 90
1.3. Кристаллическая структура комплекса рибосомного белка S8 со специфическим фрагментом 16S рРНК 93
1.4. Анализ РНК-белковых взаимодействий в S8-16S рРНК комплексах 98
1.5. Анализ РНК-белковых взаимодействий в S8-мРНК комплексе 103
2. Взаимодействия рибосомного белка L1 с РНК 104
2.1. Конформации белка L1 104
2.2. Кристаллическая структура L1-выступа 110
2.2.1. Комплекс архейного рибосомного белка L1 из Sulfolobus acidocaldarius со специфическим фрагментом 23S рРНК T.thermophilus длиной 55
нуклеотидов 110 2.2.2. Комплекс TthL1 со специфическим фрагментом 23S рРНК T.thermophilus длиной 80 нуклеотидов 114
2.3. Кристаллические структуры комплекса рибосомного белка L1 со
специфическими фрагментами мРНК разной длины 119
2.3.1. Структура регуляторного комплекса белка L1 из M. jannaschii 123
2.3.2. Структура комплекса TthL1-мРНК и сравнительный структурный анализ с комплексом TthL1-рРНК 126
2.4. Структурно-кинетический анализ взаимодействий рибосомного белка L1 и его мутантных форм c мРНК и рРНК 131
2.4.1. Особенности взаимодействия р-белка L1 со специфическими фрагментами мРНК и рРНК 131
2.4.2. Роль домена I рибосомного белка L1 во взаимодействии белка c РНК 133
2.4.3. Исследование роли консервативных водородных связей во взаимодействии рибосомного белка L1 c РНК 137
2.4.3.1. Замены Thr217 в белке TthL1 на аланин и валин 138
2.4.3.2. Замена Met218 в белке TthL1 на лейцин 142
2.4.3.3. Замена Gly219 в белке TthL1 на валин 143
2.4.3.4. Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм рибосомного белка L1 со специфическим фрагментом 23S рРНК 145
2.4.4. Роль N-концевой спирали белка TthL1 в РНК-белковых взаимодействиях 150
2.4.5. Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 c РНК 154
2.5. Исследование свойств домена I рибосомного белка L1: встраивание в рибосому и регуляция экспрессии L1-оперона 158
2.5.1. Регуляторные свойства домена I рибосомного белка L1 в системе транскрипции-трансляции in vitro 159
2.5.2. Домен I рибосомного белка L1 способен встраиваться в рибосому in vivo 160
Заключение 163
Выводы 164
ГЛАВА III. Экспериментальная часть 166
1. Материалы 166
1.1. Химические реактивы, ферменты и другие лабораторные материалы 166
1.2. Буферы и другие растворы 167
1.3. Бактериальные штаммы, векторы и рекомбинантные плазмиды 169
2. Методы 170
2.1. Методы генной инженерии, молекулярной биологии и микробиологии 170
2.1.1. Получение плазмид, несущих гены рибосомных белков и их мутантных форм 170
2.1.2. Получение плазмид, несущих гены специфических фрагментов РНК 176
2.1.3. Экспрессия генов рекомбинантных белков S8, L1 и мутантных форм L1 в клетках Е. coli 179
2.1.4. Конструирование плазмид и штаммов для экспериментов в системе in vivo 180
2.1.5. Анализ ингибирования синтеза белка MvaL1 в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro 181
2.2. Методы аналитической и препаративной биохимии 182
2.2.1. Выделение и очистка рекомбинантных белков и мутантных форм белка L1 из штаммов-продуцентов 182
2.2.2. Получение специфических фрагментов рРНК 183
2.2.3. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот, белков и РНК-белковых комплексов в ПААГ или агарозе 185
2.2.4. Анализ встраивания in vivo белка L1 и его домена I в рибосомы L1 штамма E. coli 187
2.2.5. Эксперименты по связыванию белка S8 cо специфическими фрагментами рРНК на нитроцеллюлозных фильтрах 188
2.2.6. Анализ РНК-белковых взаимодействий методом поверхностного плазмонного резонанса 189
2.3. Кристаллизация рибосомных белков S8 и L1, мутантных форм белка L1 и РНК-белковых комплексов 191
Список сокращений 200
Список литературы 201
