Введение
1. Список сокращений .5
2. Общая характеристика работы
2.1. Актуальность работы .6
2.2. Цели и задачи исследования .8
2.3. Научная новизна и практическая значимость работы 9
2.4. Апробация работы .9
2.5. Структура и объем диссертации .10
3. Обзор литературы 11
3.1. Общая характеристика клеточного ответа на тепловой шок и другие формы стрессовых воздействий 11
3.1.1. Регуляция транскрипции при стрессе .12
3.1.2. Регуляция трансляции при стрессе 13
3.1.3. Стресс эндоплазматического ретикулума 14
3.1.4. Влияние стресса на репликацию и целостность ДНК .15
3.1.5. Белки теплового шока (Hsp) и их роль в поддержание гомеостаза клеток
3.1.5.1. Функции Hsp и регуляция экспрессии генов hsp при стрессе 17
3.1.5.2. Роль Hsp в регуляции фенотипической изменчивости организмов 20
3.2. Регуляция экспрессии генов с помощью коротких некодирующих РНК 22
3.2.1. Механизмы образования и функционирования миРНК 23
3.2.2. Роли миРНК в физиологии клеток 29
3.2.3. Функции и особенности регуляции миРНК при стрессе
3.2.3.1. Типы регуляции активности миРНК и миРНК-RISC при стрессе 32
3.2.3.2. Изменение внутриклеточной локализации миРНК-белковых комплексов при стрессе 37
3.2.3.3. Функции миРНК при патологиях
3.2.4. Происхождение, образование и функции пиРНК 42
3.2.5. пиРНК-кластеры – основной источник пиРНК в герминальных тканях дрозофилы .43
3.2.6. Особенности первичного и вторичного процессинга пиРНК 45
3.2.7. Биологические функции пиРНК 48
4. Материалы и методы .52
4.1. Молекулярно-биологические методы 52
4.1.1. Использованные линии D. melanogaster 52
4.1.2. Условия теплового шока и определение термоустойчивости 52
4.1.3. Выделение тотальной РНК .52
4.1.4. Выделение геномной ДНК .53
4.1.5. Электрофорез нуклеиновых кислот 53
4.1.6. Реакция обратной транскрипции .54
4.1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) .54
4.1.8. Количественная ПЦР 55
4.1.9. Нозерн-гибридизация
4.1.10. Гибридизация по Саузерну 56
4.1.11. Клонирование и секвенирование библиотек коротких РНК 57
4.1.12. Вестерн-блоттинг 58
4.1.13. Гель-шифт анализ .59
4.1.14. Включение [35S]-Met в белки слюнных желез личинок D. melanogaster 59
4.1.15. Иммунноокрашивание яичников D. melanogaster .60
4.1.16. Статистический анализ .60
4.1.17. Последовательности использованных олигонуклеотидов 60
4.2. Биоинформатические методы
4.2.1. Обработка библиотек коротких РНК 62
4.2.2. Анализ дифференциальной экспрессии миРНК и пиРНК 62
4.2.3. Прогнозирование мишеней миРНК .63
4.2.4. Анализ генной онтологии .64
4.2.5. Анализ последовательностей .64
5. Результаты .65
5.1. Регуляция экспрессии миРНК в ответ тепловой шок
5.1.1. Особенности физиологии организма после теплового шока при недостатке Hsp70 65
5.1.2. Динамика ответа на тепловой шок при нарушении действия основного фактора транскрипции Hsf .67
5.1.3. Анализ дифференциальный экспрессии миРНК после теплового шока 69
5.1.4. Функциональный анализ мишеней термочувствительных миРНК 72
5.1.5. Анализ профилей экспрессии миРНК после теплового шока 75
5.1.6. Анализ экспрессии при-миРНК, а также генов миРНК пути в ответ на тепловой шок .81 5.1.7. Сравнительно-функциональный анализ стрессчувствительных генов и
термочувствительных миРНК .84
5.2. Особенности экспрессии пиРНК после воздействия теплового шока .87
5.2.1. Анализ дифференциальной экспрессии пиРНК после теплового шока 87
5.2.2. Локализация Hsp70 в клетках яичника дрозофилы .89
5.2.3. Поиск корреляции между уровнем экспрессии МЭ и изменением уровня экспрессии гомологичных пиРНК после теплового шока 90
5.2.4. Анализ экспрессии пиРНК-кластеров после теплового шока
6. Обсуждение .99
7. Выводы 106
8. Список цитируемой литературы 107
