Введение
Обзор литературы 9
1. История открытия tnf 9
2. Суперсемейство tnf 10
3. Структура системы tnfnfr 12
4. Функции tnf 15
5. Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний 16
6. Терапевтическая блокировка tnf 18
7. Побочные эффекты и ограничения антиnf терапии 23
8. Новые подходы и перспективы tnf блокировки 25
Материалы и методы исследования 29
1. Получение и характеристика нового верблюжьего одно доменного антитела к tnf человека 29
Экспрессия и очистка однодоменного антитела Vhh41 29
Оценка связывания антитела Vhh41 с TNF человека методом ИФА 30
Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазменного резонанса 31
Исследования способности Vhh41 блокировать TNF человека 31
2. Конструирование, получение и характеристика гибридных белков флуоресцентных сенсоров TNF 32
Конструирование генов, кодирующих сенсоры TNF. 32
Экспрессия и очистка флуоресцентных сенсоров TNF. 33
Анализ взаимодействия Vhh41-K с рекомбинантным TNF. 34
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro и in vivo . З5
Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo 36
Прижизненное изучение экспрессии TNF с помощью полученного флуоресцентного сенсора...39
3. Получение и характеристика одноцепочечного АНТИNF антитела 40
Изучение мышиного моноклонального антитела F10 40
Конструирование и экспрессия одноцепочечного антитела ahT-4 41
Измерение биологической активности одноцепочечного антитела ahT-4 42
4. Получение и характеристика химерного антиnf антитела 43
5. Конструирование, получение и характеристика биспецифических антител А9 и МА9 43
Конструирование, экспрессия и очистка антител А9 и тА9 43 Взаимодействие антител А9 и тА9 с рекомбинантным TNF человека методом
поверхностного плазменного резонанса 44
Цитотоксический тест 45
Цитофлуориметрия 45
Оценка способности биспецифического антитела А9удерживать TNF человека на
поверхности макрофагов 45
6. Сравнительная оценка эффективности системной и селективной блокировки макрофагального TNF 46
Модель острой гепатотоксичности, индуцированной введением JIIJC/D-галактозамина 46
Результаты и обсуждение 48
1. Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность 50
Создание генетической конструкции, кодирующей рекомбинантное однодоменное антитело
Vhh41 50
Экспрессия и очистка рекомбинантного однодоменного антитела Vhh41 52
Анализ взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 с TNF человека 53
Анализ способности антитела Vhh41 блокировать биологическую активность TNF человека.54
2. Конструирование, получение и характеристика молекулярных сенсоров TNF для прижизненного изучения экспрессии tnf на основе одно доменных рекомбинантных антител и красного флуоресцентного белка 56
Получение генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-Ku
контрольные гибридные белки 56
Экспрессия и очистка флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. 57
Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-К с рекомбинантным TNFмыши
и человека 58
Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-Kin vitro и in vivo. 61
Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo 66
Прижизненное изучение экспрессии TNFс помощью полученного флуоресцентного сенсора... 69
3. Получение и характеристика рекомбинантного одноцепочечного антитела, блокирующего биологическую активность TNF 72
Измерение активности мышиного моноклонального антитела F10 72
Конструирование одноцепочечного антитела на базе вариабельных фрагментов легкой и
тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела F 10 74
Измерение активности одноцепочечного антитела ahT-4 75
4. Разработка и анализ химерного антитела против TNF человека
Сравнение кинетики взаимодействий химерного антитела 13239 и инфликсимаба с
рекомбинантным TNF человека 77 Сравнение нейтрализующей активности химерного антитела 13239 с активностью
инфликсимаба in vitro 79
Анализ активности химерного антитела 13239 in vivo 80
5. Конструирование, получение и характеристика селективного б локатора tnf, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда 82
Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител 82
Взаимодействие антител А9 и тА9 срекомбинантным TNF человека 86
Блокировка антителами А9 и тА9 TNF-зависимой цитотоксичности in vitro 87
Анализ связывания антител А9 и тА9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с
поверхностной молекулой F4/80 89
Удержание эндогенно продуцируемого TNF человека на поверхности макрофагов
биспецифическим антителом А9 93
6. Физиологически значимая селективная блокировка tnf, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда in vivo 96
Сравнительная оценка эффективности направленной блокировки TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагалъного ряда, и системной блокировки TNF в модели острой
гепатотоксичности 96
Заключение 99
Список литературы 100
