Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Структура и функции митохондрий 9
1.1.1. Общее строение митохондрий 9
1.1.2. Потенциал митохондрий и синтез АТФ 12
1.1.3. Митохондриальные красители 14
1.1.4. Регуляция концентрации ионов Са2+ митохондриями 16
1.1.5. Транспорт в митохондрию 18
1.1.6. Генерация активных форм кислорода 21
1.1.7. Динамика и подвижность митохондрий 23
1.2. Промежуточные филаменты (ПФ) 26
1.2.1. Строение ПФ 27
1.2.2. Сборка ПФ
1.2.2.1. Формирование димеров 30
1.2.2.2. Формирование тетрамеров 31
1.2.2.3. Формирование протофиламентов единичной длины и дальнейшие этапы сборки 1.2.3. Динамика ПФ в клетке 34
1.2.4. Фосфорилирование белков ПФ
1.2.4.1. Фосфорилирование ПФ in vitro 36
1.2.4.2. Фосфорилирование ПФ in vivo 36
1.2.5. Функции виментина. Болезни, связанные с ПФ 38
1.3. Белок Rac1 и его эффектор протеинкиназа РАК1 40
1.3.1. Белок Rac1 42
1.3.1.1. Строение белка Rac1 42
1.3.1.2. Подходы к изучению функций белка Rac1 43
1.3.2. Функции белка Rac1 45
1.3.2.1. Регуляция концентрации АФК белком Rac1 45
1.3.2.2. Регуляция динамики цитоскелета белком Rac1 47
1.3.3. Эффектор белка Rac1 – протеинкиназа РАК1 48
1.3.3.1. Строение протеинкиназы РАК1 48
1.3.3.2. Регуляция киназной активности РАК1 49
1.3.3.3. Функции протеинкиназы РАК1 51
1.4. Перестройки цитоскелета как способ регуляции функционального состояния митохондрий 52
1.4.1. Влияние цитоскелета на распределение и функционирование митохондрий 53
1.4.2. Роль функционального состояния митохондрий в физиологии клетки. Цитотоксические препараты 55
1.4.3. Модель механизма регуляции взаимодействия митохондрий с цитоскелетом 59
Цель и задачи исследования 61
Глава 2. Материалы и методы 62
2.1. Клеточные линии и культивирование клеток 62
2.2. Трансфекция клеток 63
2.3. ДНК-конструкции
2.3.1. Конструкции, кодирующие различные формы белка Rac1 63
2.3.2. Конструкции, кодирующие различные формы виментина 64
2.3.3. Конструкции, кодирующие различные формы протеинкиназы РАК
2.4. Окрашивание клеток митохондриальными потенциалзависимыми красителями 66
2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание 2.5.1. Фиксация клеток 66
2.5.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание 67
2.5.3. Антитела к виментину и окраска актиновых микрофиламентов 67
2.6. Микроскопия 67
2.6.1. Методика проведения микроскопии живых и зафиксированных клеток 67
2.6.2. Анализ относительной подвижности митохондрий 68
2.6.3. Определение трансмембранного потенциала митохондрий 70 2.7. Получение линий клеток, стабильно экспрессирующих различные типы виментина 71
2.8. Определение устойчивости клеток к цитотоксическим препаратам 2.8.1. МТТ-тест 72
2.8.2. Тест с нейтральным красным 73
2.8.3. Построение кривых выживаемости 73
Глава 3. Результаты 75
3.1. Влияние Rac1 на подвижность и трансмембранный потенциал митохондрий 3.1.1. Сравнение относительной подвижности митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин, в присутствии мутантных форм белка Rac1 75
3.1.2. Влияние мутантных форм белка Rac1 на относительную подвижность митохондрий в клетках с восстановленным виментином 76
3.1.3. Кинетика относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих Rac1-LOV2 78
3.1.4. Влияние Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин
3.2. Поиск эффектора белка Rac1 в регуляции подвижности митохондрий 81
3.3. Проверка участия протеинкиназы РАК1 в регуляции подвижности и трансмембранного потенциала митохондрий
3.3.1. Влияние каталитического домена РАК1 на подвижность митохондрий в клетках, содержащих и не содержащих виментин 84
3.3.2. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции подвижности митохондрий 85
3.3.3. Влияние аутоингибиторного домена РАК1 на эффект Rac1 в регуляции трансмембранного потенциала митохондрий 86
3.4. Изучение роли остатка серина-55 виментина в регуляции взаимодействия митохондрий с виментином 88 3.4.1. Сборка ПФ из точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование 88
3.4.2. Влияние точечных мутантов виментина, имитирующих фосфорилирование, на подвижность митохондрий 90
3.4.3. Сборка ПФ из нефосфорилируемых аналогов виментина 90
3.4.4. Влияние нефосфорилируемых мутантов виментина на регуляцию подвижности митохондрий белком Rac1 93
3.4.5. Влияние нефосфорилируемых аналогов виментина на эффект Rac1 на трансмембранный потенциал митохондрий 94
3.5. Влияние взаимодействия митохондрий с виментиновыми ПФ на
устойчивость клеток к цитотоксическим препаратам 95
Глава 4. Обсуждение результатов 100
Выводы 111
Список принятых сокращений 112
Список литературы 115
