Введение
1 Общая характеристика работы. 6
1.1 Актуальность проблемы 6
1.2 Цель и задачи исследования 7
1.3 Научная новизна результатов исследования 8
1.4 Практическая ценность 9
1.5 Апробация работы 9
1.6 Структура и объем работы 9
2. Обзор литературы 10
2.1 РНК интерференция 10
2.1.1 Современные представления о механизме РНК-интерференции 10
2.1.2 Малые и длинные некодирующие РНК 13
2.1.3 Биогенез малых РНК 18
2.1.4 Сборка комплекса РНК-сайленсинга 22
2.1.5 Расщепление мРНК-мишени и трансляционная репрессия 27
2.1.6 Регуляция РНК-интерференции 29
2.2. Биология ВИЧ-1 30
2.2.1 Строение ВИЧ-1 30
2.2.2 Жизненный цикл ВИЧ-1 32
2.3 Использование РНК интерференции в терапии СПИДа 40
2.3.1. Основные принципы разрабатываемой генотерапии с использованием
генетических конструкций, запускающих РНК-интерференцию 40
2.3.2 Поиск мишеней в геноме ВИЧ-1 для РНК интерференции 42
2.3.3 Доставка генетических конструкций в организм 43
2.3.4 Неспецифические эффекты терапии с использованием РНК-интерференции 46
3. Материалы и методы 48
3.1 Биологические материалы 48
3.1.1. Используемые векторы 48
3.1.2. Олигонуклеотиды 50
3.1.3. Культуры клеток 51
3.2. Создание генетических конструкций 52
3.2.1. Вставки для экспересии отдельных siPHK и вставки-домены 52
3.2.2. Кассетные вставки 52
3.2.3. Клонирование 55
3.3. Испытание созданных конструкций в невирусной системе 60
3.3.1. Очистка и нормализация препаратов плазмидной ДНК 60
3.3.2. Трансфекция 60
3.3.3. Измерение люминесценции люцифераз 3.4 Выделение тотальной РНК 63
3.5 Детекция siPHK методом защиты отРНКазы 63
3.4.1. Приготовление меченной РНК 64
3.4.3 Детекция siPHK 64
3.6 Детекция активации интерферон-зависимого ответа методом ОТ-ПЦР 65
3.6.1 Синтез кДНК 65
3.6.2 Праймер-специфичная амплификация 66
3.7. Испытание генетических конструкций в псевдолентивирусной системе 66
3.7.1. Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК 66
3.7.2. Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ siRNA 67
4. Результаты и обсуждение 68
4.1 Выбор мишеней РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1 68
4.2 Эффективность РНК-интерференции, вызываемой генетической конструкцией, зависит от силы промотора 71
4.3 Генетические конструкции, экспрессирующие удлинённые шпильки, запускают более эффективную РНК-интерференцию 74
4.4 Новый метод создания кассетных генетических конструкций с использованием олигонуклеотидов, не образующих шпильки 78
4.5 Испытание кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK, в невирусной системе 82
4.6 Испытание генетических конструкций, экспрессирующих siPHK, в псевдолентивирус-клеточной системе 88
4.6.1 Расположение и структура сайтов-мишеней для анти-ВИЧ siPHK в последовательностях транскриптов системы лентивирусной экспрессии in vitro 89
4.6.2 Подавление продукции псевдолентивирусов в клетках линии НЕК-293Т путем коэкспрессии siPHK, направленных против разных мишеней в лентивирусном геноме .90
4.7 Генетические конструкции, экспрессирующие siPHK, не вызывают активации
неспецифического интерферон-зависимого ответа 96
4.7.1 Анализ возможной активации интерферонового пути 97
4.7.2 Гены, использованные в детекции активации интерферонового пути 97
4.7.3 Вариабельность неспецифического интерферонового ответа 98
Выводы 100
Список литературы
