Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы 25
Глава 1. Промоторы каулимовирусов 27
Глава 2. Регуляция размеров органов у растений 36
2.1. Молекулярные механизмы регуляции роста и развития растений 39
2.2. Регуляция клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега
2.3. Морфогенез листа
2.3.1. Рост листа 49
2.3.2. Генетический контроль морфогенеза листа
2.4. Транскрипционные факторы, участвующие в регуляции роста растений
2.5. Молекулярные механизмы регуляции клеточного деления
2.5.1. Ген ARGOS 59
2.5.2. Транскрипционный фактор ArNTEGUMENTA 61
2.5.3. Циклины и циклин-зависимые протеинкиназы 64
2.5.4. Ген CYCLIND3;! 67
Глава 3. Регуляция роста клеток растяжением в растениях
3.1. Регуляция поступления воды в клетки растений 71
3.2. Фитогормоны и другие низкомолекулярные соединения 74
3.3. Сигнальные пептиды 80
3.4. Белки с OSR-доменом 81
3.5. Транскрипционные факторы 82
3.6. Эндогликаназы 84
3.7. Ксилоглюканэндотрансгликозилазы/гидролазы
3.8. Экспансиям 87
3.9. Другие неферментативные белки
3.10. Цитоскелет 91
3.11. Эндоредупликация 92
Заключение к обзору литературы 95
ЧАСТЬ 2. Экспериментальная часть 98
Глава 4. Объекты и методы исследования
4.1. Краткая характеристика объектов исследований 98
4.2. Выделение и очистка тотальной ДНК растений и каулимовирусов методом фенольно-хлороформной экстракции
4.3. Выделение и очистка тотальной ДНК растений методом солевой экстракции
4.4. Выделение тотальной РНК растений тризолом и построение первой цепи кДНК для клонирования генов
4.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК 101
4.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами и реакция лигирования
4.7. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т
4.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
4.9. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
4.10. Элюция ДНК из агарозных гелей 106
4.11. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой 107
4.12. Выделение тотальной ДНК бактерий при помощи 0,5%-ного 108 тритона Х-100 для ППР-анализа
4.13. Полимеразная цепная реакция 108
4.14. Проведение RAPD-анализа бактериальных клонов 109
4.15. ПЦР-ПДРФ-анализ ампликонов 109 4.16. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным 110 методом
4.17. Получение одноцепочечной ДНК с помощью ДНК-полимеразы 110 фага phi 29
4.18. ДНК шаффлинг 112
4.19. Выделение тотального белка из растений 113
4.20. Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных 113
экстрактах
4.21. Подготовка компетентных клеток Е. сої і 114
4.22. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК 115
4.23. Подготовка электрокомпетентных клеток A. tumefaciens 115
4.24. Электропорация компетентных клеток A. tumefaciens 116
4.25. Приготовление протопластов из листьев табака N. tabacum 117
4.26. Трансформация протопластов табака методом химически 118 индуцированного эндоцитоза
4.27. Агробактериальная трансформация листовых дисков табака 119
4.28. Анализ Р-глюкуронидазной активности 121
4.29. Стерилизация семян трансгенных растений табака 122
4.30. Морфологический анализ трансгенных растений табака 122
4.31. Экзогенная обработка трансгенных растений табака 124
эстрадиолом
4.32. Экзогенная обработка растений табака фитогормонами 125
4.33. Нумерация листьев и построение кДНК для анализа уровня 125
содержания транскриптов исследуемых генов
4.34. Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени 127
4.35. Определение концентрации цитокининов, ИУК и АБК 127
4.36. Гистологический анализ тканей трансгенных растений 128
4.37. Определение плоидности трансгенных растений 128
4.38. Получение трансгенных растений рапса методом погружения цветков (floral dip)
4.39. Получение трансгенных растений осины при помощи 130
Argobacterium rhizogenes с использованием игольчатых кристаллов карбида кремния
4.40. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 131
4.41. Статистическая обработка полученных результатов 131
Глава 5. Реактивы и материалы 133
5.1. Бактериальные штаммы для молекулярно-биологических манипуляций, плазмидные и фагмидные векторы
5.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ГЩР, ОТ-ГЩР и ОТ-ГЩР в реальном времени
5.3. Реактивы и материалы 139
5.4. Составы использованных стандартных растворов 141
ЧАСТЬ 3. Результаты и обсуждение 143
Глава 6. Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их гибридных форм методами рестрикции-лигирования и ДНК шаффлинга
6.1. Выяснение филогенетических связей каулимовирусов, поиск промоторных последовательностей, подбор праймеров для их амплификации и поиск инфицированных каулимовирусами растений
6.2. Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина
6.3. Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики
6.4. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора вируса мозаики георгина
6.5. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики
6.6. Конструирование гибридных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга
6.7. Анализ активности генов GUS и GFP под управлением гибридных и природных форм промоторов каулимовирусов в клетках Е. coli, A. tumefaciens и N. tabacum
6.8. Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов методами ПЦР и рестрикции-лигирования
6.9. Определение активности природных и гибридных форм промоторов каулимовирусов флюориметрическим методом
6.10. Обсуждение результатов 160
Глава 7. Роль генов, контролирующих клеточную пролиферацию в апикальной меристеме побега и зачатках органов, в регуляции размеров листьев, стебля и цветков
7.1. Конститутивная экспрессия гена CLAVATA3 A. thaliana в трансгенных растениях табака
7.1.1. Клонирование гена CLAVATA3 A. thaliana и создание целевых генно-инженерных конструкций
7.1.2. Морфофизиологический и молекулярный анализ трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена CLAVATA3
7A3. Обсуждение результатов 185
7.2. Участие гена AINTEGUMENTA и его ортологов в регуляции размеров надземных органов
7.2.1. Исследование функций гена AINTEG UMENTA табака 189
7.2.2. Морфологические особенности трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ANT рапса под контролем промотора вируса мозаики георгина
7.2.3. Конститутивная экспрессия генов PnANTLl и PnANTL2 тополя черного в трансгенных растениях табака
7.2.4. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих консервативные участки гена ANT в антисмысловой ориентации
7.3. Заключение к главе 7 248
Глава 8. Роль (957?-генов в регуляции размеров органов растений 252
8.1. Конститутивная экспрессия гена AtARGOS под контролем промотора вируса мозаики георгина
8.1.1. Поиск гомологов гена AtARGOS A. thaliana в GenBank и сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков
8.1.2. Получение генно-инженерной конструкции гена AtARGOS с промотором вируса мозаики георгина и сайтом polyA вируса
мозаики цветной капусты в векторе pCambia 2301
8.1.3. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AtARGOS A. thaliana и их морфологический анализ
8.1.4. Обсуждение результатов 261
8.2. Влияние конститутивной экспрессии гена AtARL на размеры 263
клеток и органов трансгенных растений табака
8.2.1. Поиск гомологов гена AtARL A. thaliana и биоинформационный анализ его предсказанной белковой молекулы
8.2.2. Амплификация гена AtARL A. thaliana и получение генно- инженерных конструкций целевого гена в векторах pCambia 1301 и pCambia 1305.1
8.2.3. Морфологический и молекулярный анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AtARL A. thaliana
8.2.4. Сравнительная морфологическая характеристика трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AtARL A. thaliana под контролем промотора ВМГ
8.2.5. Обсуждение результатов 274
8.3. Эстрадиол-индуцибельная и цветокспецифичная экспрессия генов AtARGOS и AtARL в трансгенных растениях табака
8.3.1. Морфофизиологический и молекулярный анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих гены AtARGOS и AtARL А. thaliana под контролем промотора хальконсинтазы петунии
8.3.2. Морфофизиологический и молекулярный анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих гены AtARGOS и AtARL под контролем эстрадиол-индуцибельной системы транскрипции
8.3.3. Обсуждение результатов 289
8.4. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих фрагмент гена. AtARGOS в антисмысловой ориентации
8.4.1. Поиск и клонирование консервативных фрагментов гена AtARGOSA. thai і ana
8.4.2. Сравнительная морфофизиологическая характеристика трансгенных растений табака, экспрессирующих участок гена AtARGOS A. thaliana в антисмысловой ориентации
8.4.3. Обсуждение результатов 299
8.5. Клонирование и исследование гена PnARGOS-LIKE тополя черного
8.5.1. Определение филогенетического родства гена PnARGOS-LIKE, биоинформационный анализ его предсказанной аминокислотной последовательности и промоторной области
8.5.2. Оценка содержания мРНК гена PtrARGOS-LIKE в различных органах осины и под действием экзогенных фитогормонов и NaCl
8.5.3. Молекулярный и морфологический анализ трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих ген PnARGOS-LIKE
8.5.4. Молекулярный и морфологический анализ трансгенных растений осины, сверхэкспрессирующих ген PnARGOS-LIKE
8.5.5. Обсуждение результатов 316
8.6. Создание трансгенного рапса, сверхэкспрессирующего ген AtARL методом погружения цветков
8.6.1. Получение трансгенных растений рапса методом погружения цветков и отбор предполагаемых трансгенных форм по фенотипу
8.6.2. Отбор трансгенных растений рапса методом ПЦР-анализа 326
8.6.3. Молекулярный и морфологический анализ трансгенных растений рапса, экспрессирующих ген AtARL A. thaliana
8.6.4. Обсуждение результатов 331
8.7. Заключение к главе 8 333
Глава 9. Роль генов, контролирующих рост клеток растяжением в регуляции размеров органов
9.1. Роль гена эндоксилоглюкантрансферазы NtEXGT при росте растений и регуляции размеров органов
9.1.1. Определение филогенетических связей гена NtEXGT с его гомологами из некоторых представителей двудольных
9.1.2. Анализ уровня транскрипции гена NtEXGT в различных органах табака дикого типа
9.1.3. Анализ уровня транскрипции гена NtEXGT в различных органах табака дикого типа под влиянием экзогенных фитогормонов
9.1.4. Анализ изменений уровня транскрипции гена NtEXGT под влиянием избыточной NaCl, холода, кадмия и «стрессовых» фитогормонов
9.1.5. Участие генов AtARGOS, AtARL и NtANTL в регуляции 349 экспрессии гена NtEXGT
9.1.6. Морфологический анализ трансгенных растений, 351 сверхэкспрессирующих кДНК форму гена NtEXGT
9. Морфологический анализ трансгенных растений, сверхэкспрессирующих геномную форму гена NtEXGT
9.1.8. Изменения длины корней трансгенных по гену NtEXGT растений табака при действии NaCl
9.1.9. Обсуждение результатов 357
9.2. Роль генов экспансинов NtEXPAl, ШЕХРА4, ШЕХРА5 и ШЕХРА6 при регуляции роста и размеров органов табака
9.2.1. Определение филогенетических связей генов экспансинов табака с их гомологами из A. thaliana, томатов и тополя
9.2.2. Анализ уровня транскрипции генов NtEXPAl, ШЕХРА4, ШЕХРА5 и ШЕХРА6 в различных органах табака дикого типа
9.2.3. Изменения уровня транскрипции генов экспансинов табака в ответ на экзогенную обработку цитокининами, ауксинами, брассиностероидами и гиббереллинами
9.2.4. Анализ изменений уровня транскрипции генов экспансинов под влиянием избыточной NaCl, холода и «стрессовых» фитогормонов
9.2.5. Влияние индуцибельной экспрессии гена AtARL на изменение уровня транскрипции генов экспансинов табака
9.2.6. Получение и морфологический анализ трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией геиа.МЕХРА1
9.2.7. Конститутивная экспрессия гена ШЕХРА5 в трансгенных растениях табака
9.2.8. Морфофизиологическая характеристика трансгенных растений табака, экспрессирующих участок гена ШЕХРА4 в антисмысловой ориентации
9.2.9. Обсуждение результатов 396
9.3. Конститутивная экспрессия гена AtEXPAlO A. thaliana в трансгенных растениях табака
9.3.1. Амплификация и клонирование гена AtEXPAlO 408
9.3.2. Получение трансгенных растений табака, с повышенной экспрессией гена AtEXPAlO
9.3.3. Морфологический анализ трансгенных растений табака с повышенной экспрессией гена AtEXPAlO
9.3.4. Обсуждение результатов 414
9.4. Клонирование и исследование генов экспансинов 416
тополя черного (P. nigra)
9.4.1. Конститутивная экспрессия гена РпЕХРАІ в трансгенных растениях табака
9.4.2. Конститутивная экспрессия гена РпЕХРАЗ в трансгенных растениях табака
9.5. Заключение к главе 9 431
Часть 4. Общее заключение 435
Основные выводы 438
Список литературы
