Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
2.1 Роль регуляторов активности р53 в онкогенезе 12
2.1.1 Р53-ОСНОВНОЙ онкосупрессор человека 12
2.1.2 Set7/9 позитивный регулятор р53 15
2.1.3 Р53-независимые функции Set7/9 16
2.1.4 MDM2 - основной негативный регулятор р53 17
2.1.5 Структура MDM2 и его сплайс-изоформ 21
2.1.6 Р53-независимые онкогенные функции MDM2 23
2.1.7 MDM2 как онкосупрессор 25
2.1.8 Роль сплайс-изоформ MDM2 в онкогенезе 26
2.1.9 Ингибиторы взаимодействия р53 с MDM2 как потенциальные противоопухолевые препараты 28
2.2 Доксорубицин и цисплатин как широко применяемые генотоксические противоопухолевые агенты 30
2.2.1 Репарация ДНК как фактор эффективности генотоксической противоопухолевой терапии 30
2.2.2 Цисплатин 31
2.2.3 Доксорубицин 33
2.3 Одноуглеродный метаболизм и биосинтез нуклеотидов в раковых клетках как мишени для противоопухолевой терапии 34
2.3.1 Специфические изменения в метаболизме как характерная особенность раковых клеток 34
2.3.2 Одноуглеродный метаболизм 35
2.3.3 Нарушения одноуглеродного метаболизма и путей биосинтеза нуклеотидов в раковых клетках
2.3.4 Нарушение метаболизма серина и глицина в раковых клетках 41
2.3.5 Одноуглеродный метаболизм и биосинтез нуклеотидов как мишени противоопухолевой терапии 43
ГЛАВА II Материалы и методы
2.1 Клеточные культуры 45
2.1.1 Культивирование клеточных культур 45
2.1.2 Трансфекция клеток 45
2.1.3 Получение клеток с нокдауном SET7/9 и MDM2 46
2.1.4 Обработка клеток химиотерапевтическими препаратами
2.2 Выделение РНК и синтез кДНК 47
2.3 ПЦР в режиме «реального времени» 48
2.4 Получения ДНК-последовательностей основной, а так же сплайс-изоформ MDM2 49
2.5 Создание векторных конструкций, несущих делеционные варианты и изоформы MDM2 и Set7/9 для про- и эукариотической экспрессии 50
2.6 Создание векторных конструкций, кодирующих полноразмерную серингидроксиметилтрансферазу SHMT2 и отдельные её домены 52
2.7 Получение клеточного экстракта 53
2.8 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 53
2.9 Метод GST-pulldown 54
2.10. Масс-спектрометрия 54
2.11. Ко-иммуннопреципитация 2.12 Убиквитинилирование in vivo 55
2.13 Разделение белков в ПААГ и последующая окраска Кумасси 56
2.14 Вестерн-блоттинг 57
2.15 Оценка выживаемости клеток после обработки химиотерапевтическими препаратами 58
Глава III. Результаты 60
3.1 SET7/9 и MDM2 образуют петлю отрицательной обратной связи 60
3.1.1 Нокдаун Set7/9 повышает экспрессию MDM2 при генотоксическом стрессе 60
3.1.2 Экпрессия изоформ MDM2 по-разному влияет на восприимчивость клеток к генотоксическим агентам доксорубицину и цисплатину 62
3.1.3 MDM2 взаимодействует физически с SET7/9, а так же контролирует уровень его экспрессии 64
3.2 Определение интерактома MDM2 и SET7/9 66
3.2.1 Выявление спектра белков, ассоциированных с рекомбинантной метилтрансферазой Set7/9 66
3.2.2 Выявление спектра белков, ассоциированных с рекомбинантной ЕЗ-убиквитин лигазой MDM2
3.2.3 Анализ результатов GST pull down и отбор белков, играющих важную роль в онкогенезе 87
3.2.4 Верификация данных масс-спектрометрической идентификации ассоциированных с MDM2 белков с использованием иммунноблотинга 92
3.3 Влияние SET7/9 и MDM2 на ключевые факторы одноуглеродного метаболизма 94
3.3.1 Нокдаун Set7/9 повышает экспрессию MTHFD2 и SHMT2, а так же их транскрипционного регулятора с-Мус 94
3.3.2 Структурно-функциональной роль взаимодействия ЕЗ -убиквитин лигазы MDM2 с серингидроксиметилтрансферазой SHMT2 96
3.3.3 Set7/9 и MDM2 модулируют восприимчивость к ингибитору одноуглеродного метаболизма - метатрексату 100
ГЛАВА IV Обсуждение 103
4.1 MDM2 образует с Set7/9 петлю отрицательной обратной связи и контролирует восприимчивость клеток к генотоксическим химиопрепаратам.. 103
4.2 MDM2 и Set7/9 принимают участие в различных клеточных процессах и имеют общих интерактантов 107
4.3 MDM2 и Set7/9 контролируют экспрессию SHMT2 и MTHFD2 и влияют на устойчивость клеток к метатрексату 110
Основные выводы: 115
Список литературы 116
