Введение
ГРАВА 1. Обзор литературы 26
1.1. Методы стимуляции регенерации разных тканей и органов при ишемических и дегенеративных заболеваниях в рамках регенеративной медицины 26
1.2. Генная терапия при нейродефицитах
1.2.1. Антисмысловые олигонуклеотиды 28
1.2.2. РНК-интерференция 29
1.2.3. Вирусная трансдукция 32
1.2.4. Плазмидные векторы 37
1.3. Ресурсы стволовых клеток для регенеративной медицины 40
1.3.1. Клеточная терапия при нейродегенеративных заболеваниях 41
1.3.2. Эмбриональные стволовые клетки 42
1.3.3. Мезенхимные стволовые клетки 44
1.3.4. Стволовые нервные клетки 48
1.3.5. Мононуклеарные клетки пуповинной крови (МКПК) 49
1.3.5.1. Трансплантация МКПК, их участие в повышении
жизнеспособности нервных клеток и стимулировании нейрорегенерации
1.3.5.2. Биологически активные молекулы, секретируемые МКПК
1.4. Применение генетически модифицированных стволовых клеток для
клеточной терапии 56
1.4.1.Подходы к генетической модификации клеток 57
1.4.2.Трансплантация стволовых клеток после их генетической модификации 60
1.4.3.Генетическая модификация МКПК для нейрорегенерации 63
1.5. Боковой амиотрофический склероз, терапия при помощи генетически модифицированных МКПК 64
1.6. Молекулы адгезии, представитель иммуноглобулинов — молекула адгезии L1CAM 67
1.7. Нейротрофические факторы — стимуляторы нейрорегенерации
1.7.1. Сосудистый эндотелиальный фактор роста 70
1.7.2. Глиальный нейротрофический фактор 72
1.7.3. Фактор роста фибробластов 2 74
1.8. Транскрипционные факторы 75
1.8.1. Sox2 77
1.8.2. Oct4 78
1.8.3. Функции комплекса Sox2/Oct4 79
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 82
2.1. Создание экспрессионных плазмидных векторов 82
2.1.1. Проведение полимеpазной цепной реакции (ПЦР) 82
2.1.2. Получение необходимых последовательной генов с ипользованием гидролиза ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами 84
2.1.3. Реакция дефосфорилирования нуклеиновых кислот 85
2.1.4. Проведение лигирования фрагментов плазмидных векторов 86
2.1.5. Разделение фрагментов ДНК при помощи электрофореза 87
2.1.6. Выделение рестрикционных фрагментов и продуктов ПЦР реакции из агарозного геля 87
2.1.7. Получение плазмидной ДНК 88
2.1.8. Секвенирование первичной нуклеотидной последовательности ДНК 89
2.2. Использование прокариотических клеток для получения плДНК 90
2.2.1. Приготовление и трансформация компетентных клеток E. coli 91
2.3. Использование эукариотических клеток для анализа рекомбинантных конструкций 92
2.3.1. Клетки НЕК293Т 92
2.3.2. МКПК человека – заготовка, культивирование 93
2.3.3. Трансфекция – метод переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки
2.3.2.1. Трансфекция НЕК293Т клеток с использованием синтетических катионных липидов 95
2.3.2.2. Генетическая модификация МКПК человека при помощи электропорации 95
2.3.4. Проведение анализа эффективности трансфекции 96
2.3.3.1. Флуоресцентная микроскопия 96
2.3.3.2. Пpoтoчная цитoфлуoметpия 96
2.4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков in vitro 96
2.4.1. Иммунoцитoхимические исследования 96
2.4.2. Вестерн блоттинг 98
2.5. Исследование экспрессии генов 99
2.5.1. Выделение РНК из клетoчных культуp НЕК293Т и МКПК, трансфицированных двухкассетными плазмидами 99
2.5.2. Pеакция oбpатнoй тpанскpипции 100
2.5.3. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени для количественной оценки экспрессии мРНК генов 101
2.6. Опыты in vivo 103
2.6.1. Трансгенные животные с фенотипом БАС 104
2.6.2. Трансплантация генетически модифицированных клеток трансгенным мышам G93A 105
2.7. Гистологические исследования 106
2.7.1. Обработка образцов ткани для иммуногистохимического анализа 106
2.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание 107
2.9. Программное обеспечение и статистическая обработка результатов 108
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1. Рабочая гиппотеза 110
3.2. Влияние белков нейрональной молекулы адгезии L1CAM и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF165 на дифференцировку МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАС
1 3.2.1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов L1cam, vegf165 и egfp 113
3.2.2. Анализ экспрессии мРНК клонированных генов и биосинтеза рекомбинантных белков 120
3.2.2.1. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов vegf и L1cam 120
3.2.2.2. Анализ биосинтеза рекомбинантных белков 121
3.2.3. Генетически модифицированные МКПК, экспрессирующие EGFP, выживают, мигрируют и дифференцируются в эндотелиальные клетки и клетки микроглии в спинном мозге мышей G93A после ретроорбитальной трансплантации 123
3.2.4 Рекомбинантные белки L1CAM и VEGF165 поддерживают эндогенный потенциал МКПК дифференцироваться в эндотелиальные клетки 126
3.3. Рекомбинантные белки VEGF165 и FGF2 инициируют дифференцировку МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC, в астроциты 136
3.3.1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов vegf165 и fgf2 137
3.3.2. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов vegf165 и fgf2 139 3.3.3. Анализ биосинтеза рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 140
3.3.4. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF165-FGF2, после 14 суток трансплантации мышам G93A 142
3.4. Одновременная экспрессия рекомбинантных белков VEGF165 и GDNF поддерживает эндогенный потенциал МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC 145
3.4.1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов vegf165 и gdnf 146
3.4.2. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов vegf165 и gdnf 147
3.4.3. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-GDNF, после 14 суток трансплантации мышам G93A 148
3.5. Влияние одновременной экспрессии рекомбинантных белков GDNF и FGF2 на фенотип МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC 151
3.5.1. Создание плазмидной конструкции, кодирующей кДНК генов gdnf и fgf2 152
3.5.2. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-GDNF-FGF2, после 14 суток трансплантации мышам G93A 153
3.6. Влияние транскрипционных факторов Sox2 и Oct4 на дифференцировку МКПК после их трансплантации мышам G93A с фенотипом БАC 156
3.6.1. Создание плазмидной конструкции, кодирующей кДНК генов Sox2 и Oct4 157
3.6.2. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов Sox2 и Oct4 158
3.6.3. Анализ биосинтеза рекомбинантных белков Sox2 и Oct4 159
3.6.4. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-Sox2-Oct4, после 14 суток трансплантации мышам G93A 160
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 166
выводы 176
