Введение
1. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Задачи исследования 8
1.3. Научная новизна результатов исследования 9
1.4. Практическая ценность 9
1.5. Апробация работы 9
2. Обзор литературы 10
2.1. История изучения РНК-интерференции 10
2.2. Современные представления о механизме РНК-интерференции 15
2.3. Эндогенные короткие РНК у эукариот 21
2.4. ПроцессингдцРНК-образование коротких РНК 22
2.5. Разрезание мРНК и подавление трансляции, направляемое короткими РНК 24
2.6. Репрессия хроматина, направляемая короткими РНК 26
2.6.1. Общие представления о структуре хроматина 26
2.6.2. Короткие РНК и формирование гетерохроматина у дрожжей 27
2.6.3. РНК-интерференция и подавление транскрипции генов у растений 30
2.6.4. Косупрессия у растений 31
2.6.5. Метилирование ДНК и аппарат РНК-интерференции 33
2.6.6. РНК-сайленсинг на уровне хроматина у животных 37
2.7. РНК-интерференция и репрессия мобильных элементов 40
2.8. Заключение 43
3. Материалы и методы 45
3.1. Биологические материалы 45
3.2. Использованные праймеры 45
3.3. Линии Drosophila melanogaster и генетические скрещивания 47
3.4. Трансформация эмбрионов Drosophila 49
3.5. Гистохимическая окраска органов на активность Р-галактозидазы 51
3.6. Количественное определение активности Р-галактозидазы 51
3.7. Стандартные молекулярно-биологические методы 52
3.8. Создание Ste-lacZ конструкций 52
3.9. Лигирование ДНК и трансформация клеток Е. coli 53
3.10. Выделение плазмидной ДНК 53
3.11. Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей 54
3.12. Выделение геномной ДНК Drosophila 54
3.13. Выделение тотальной РНК Drosophila 55
3.14. Саузерн-блот гибридизация с геномной ДНК 56
3.15. ОТ-ПЦР 58
3.16. Полуколичественный ПЦР 58
3.17. Анализ доступности хроматина для ДНКазы I 59
3.18. Хроматин иммунопреципитация (Х-СЫР) 60
3.19. Форез ПЦР-продуктов в акриламидном денатурирующем геле 62
3.20. Т7 транскрипция молекул дцРНК 63
3.21. Процессинг дцРНК в лизатах семенников и культуры KneioK Drosophila melanogaster 64
3.22. Форез РНК в акриламидном денатурирующем геле 65
4. Результаты 66
4.1. Мутации в генах РНК-интерференции рШ и spn-E вызывают дерепрессию ретротранспозонов в терминальных тканях 66
4.2. Антисмысловая транскрипция copia не регулируется аппаратом РНК- интерференции 72
4.3. Мутация spn-E вызывает увеличение доступности хроматина ретротранспозонов к ДНКазеІ 73
4.4. Дерепрессия ретротранспозонов сопровождается ацетилированием гистона НЗ и связыванием транскрипционных комплексов с промоторами 77
4.5. Удаление повторов Su(Ste) приводит к возрастанию количества несплайсированных транскриптов Stellate 83
4.6. Повторы Su(Ste) направляет компактизацию хроматина генов Stellate 88
4.7. Регуляция экспрессии гена Stellate повторами Su(Ste) осуществляется при замене собственного промотора Stellate на гетерологичный 90
4.8. Гомология с Su(Ste) в транскрибируемой области генов Stellate необходима для осуществления репрессии 92
4.9. «Неканонический» размер siPHK Su(Ste) не определяется особенностями процессинга дцРНК в семенниках 95
5. Обсуждение результатов 97
5.1. Регуляция экспрессии ретротранспозонов с помощыюРНК- интерференции в терминальных и соматических тканях 97
5.2. Участие РНК-интерференции в репрессии ретротранспозонов на уровне хроматина 101
5.3. Подавление транскрипции генов Stellate за счет дцРНК Su(Ste) 106
5.4. Различная регуляция кластеров ^/еЯя/е^асположенных в эу- и гетерохроматине 108
5.5. Значение транскрибируемой области генов Stellate .для их регуляции 110
5.6. Различные типы коротких РНК у дрозофилы 111
Выводы 115
