Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Влияние жирных кислот и Са на состояние и свойства фосфолипидных мембран 14
1.1.1. Фазовые переходы липидных мембран 14
1.1.1.1. Фазовые переходы бислойных структур 15
1.1.1.2. Полиморфные фазовые переходы
1.1.2. Влияние жирных кислот на фазовое состояние фосфолипидных мембран 20
1.1.3. Влияние свободных жирных кислот на проницаемость липидных мембран ..
1.1.3.1. Детергеноподобное действие жирных кислот 21
1.1.3.2. Жирные кислоты как агенты, влияющие на упаковку мембран 22
1.1.3.3. Протонофорное действие жирных кислот 9+
1.1.4. Взаимодействие Са с фосфолипидными мембранами, содержащими отрицательно-заряженные липиды 24
1.2. Взаимодействие жирных кислот с биологическими мембранами 27
1.3. Взаимодействие жирных кислот с митохондриями 30
1.3.1. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования 9+
1.3.2. Митохондриальная Са -зависимая пора. Роль жирных кислот в индукции 9+ неспецифической Са -зависимой проницаемости митохондрий 35
1.3.2.1. Возникновение и развитие представлений о неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны 35
1.3.2.2. Общая характеристика МРТ поры 37
1.3.2.3. Молекулярная структура МРТ поры
1.3.2.3.1. Роль циклофилина Д в формировании МРТ поры 40
1.3.2.3.2. Роль аденилаттранслокатора в формировании МРТ поры 41
1.3.2.3.3. Роль фосфатного переносчика в формировании МРТ поры 42
1.3.2.3.4. Роль F0F1 АТФ синтазы в формировании МРТ поры 43
1.3.2.3.5. Роль белков внешней мембраны митохондрий в формировании МРТ поры
1.3.2.4. Физиологическая и патофизиологическая роль МРТ поры 46
1.3.2.5. Митохондриальная циклоспорин А-нечувствительная пора. Участие жирных кислот в индукции Са -зависимой пермеабилизации митохондрий 49
1.4. Программируемая клеточная гибель. Пальмитиновая кислота как природный индуктор апоптоза 51
1.4.1. Общая характеристика апоптоза 51
1.4.2. Роль митохондрий в апоптозе 54
1.4.3. Пальмитиновая кислота как природный индуктор апоптоза 57
1.5. Фосфолипаза Ai как регулятор процессов, индуцируемых жирными кислотами 59
1.5.1. Секреторные фосфолипазы Аг 60
1.5.2. Цитозольные Са -зависимые фосфолипазы Аг 61
1.5.3. Цитозольные Са -независимые фосфолипазы Аг 64
2. Материалы и методы исследования 67
2.1. Эксперименты с липосомами 67
2.1.1. Приготовление однослойных липосом 67
2.1.2. Приготовление липосом, загруженных сульфородамином Б 67
2.1.3. Измерение выхода сульфородамина Б из однослойных липосом 67
2.1.4. Определение фазовой сеперации в мембранах липосом с помощью нонил-акридинового оранжевого 68
2.1.5. Измерение параметра GP (генерализованная поляризация) лаурдана 69
2.1.6. Определение слияния липосом 70
2.1.7. Определение размера липосом 70
2.1.8. Определение С, потенциала липосом 70
2.1.9. Акустические исследования 71
2.2. Эксперименты с митохондриями 71
2.2.1. Выделение митохондрий из печени крыс 71
2.2.2. Выделение митохондрий из сердца крыс 72
2.2.3. Выделение митохондрий из мозга крыс 72
2.2.4. Получение митопластов из митохондрий печени крыс 73
2.2.5. Оценка функциональных параметров митохондрий 73
2.2.6. Электронная микроскопия митохондрий 75
2.2.7. Электрофорез и иммуноблоттинг 75
2.3. Экстракция, разделение и количественный анализ липидов из биологических
объектов 76
2.3.1. Экстракция и определение фосфолипидов 76
2.3.2. Выделение фракции жирных кислот и ее количественный анализ 76
2.4. Эксперименты с эритроцитами крыс 76 2.4.1. Выделение эритроцитов крыс 76
2.4.2. Загрузка эритроцитов сульфородамином Б 77
2.4.3. Измерение неспецифической проницаемости эритроцитарной мембраны 77
2.5. Эксперименты с первичной культурой нейронов мозжечка крысы 78
2.5.1. Культивирование первичной культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы 78
2.5.2. Флуоресцентно-микроскопические измерения 78
2.6. Эксперименты с клетками Escherichia coli 79
2.6.1. Культивирование клеток Е.coli 79
2.6.2. Трансформация клеток Е.coli 79
2.6.3. Молекулярный докинг взаимодействия ингибиторов фосфолипаз Аг с димером фосфолипазы А внешней мембраны Е.coli 80
2.7. Статистическая обработка результатов 80
3. Результаты исследования и их обсуждение 81
3.1. Са -зависимая пермеабилизация биологических и искусственных мембран, индуцируемая жирными кислотами 81
9+
3.1.1. Са -зависимая пермеабилизация однослойных липосом, индуцируемая жирными кислотами 81
3.1.2. Са -зависимая циклоспорин А-нечувствительная пермеабилизация внутренней митохондриальной мембраны, индуцируемая жирными кислотами
3.1.3. Са -зависимая пермеабилизация плазматической мембраны эритроцитов, индуцируемая жирными кислотами
3.2. Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой жирными кислотами
3.2.1. Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой насыщенными жирными кислотами 96
3.2.1.1. Пальмитат/Са -зависимая пермеабилизация липосом происходит вследствие образования липидных пор 96
3.2.1.2. Пальмитат/Са -индуцируемая пермеабилизация мембраны сопряжена с фазовой сегрегацией комплексов Са с жирной кислотой 97
3.2.1.3. Пальмитат/Са -индуцируемое образование липидных пор происходит по механизму хемотропного ламеллярного фазового перехода
3.2.1.4. Образование липидных пальмитат/Са -индуцируемых пор во внутренней мембране митохондрий печени и плазматической мембране эритроцитов крыс
3.2.2. Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой ненасыщенными и дикарбоновыми жирными кислотами 109
3.2.2.1. Са не вызывает изменение температуры главного фазового перехода мембраны липосом, содержащих ненасыщенные и дикарбоновые жирные кислоты 109
3.2.2.2. Ненасыщенные и дикарбоновые жирные кислоты индуцируют Са зависимое слияние липосом 111
3.2.2.3. Пальмитиновая кислота индуцирует Са -зависимое набухание митопластов, а олеиновая кислота - нет 114
3.2.3. Заключение 115
3.3. Регуляция липидной пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 116
3.3.1. Влияние агентов, связывающих Са и жирную кислоту, на открытие
пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 117
3.3.2. Влияние модуляторов поверхностного потенциала на открытие
пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 119
3.3.2.1. Влияние ионного состава среды инкубации на открытие
пальмитат/Са -индуцируемой поры в липосомах и митохондриях 120
3.3.2.2. Влияние спермина и ионов Mg на открытие пальмитат/Са индуцированной поры в митохондриях и липосомах 122
3.3.2.3. Влияние рН среды инкубации на открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 124
3.3.2.4. Влияние амфифильных заряженных соединений на открытие пальмитат/Са -индуцируемой липидной поры в митохондрях и липосомах 125
3.3.3. Влияние липидного окружения на открытие пальмитат/Са -индуцированной
поры в митохондриях и липосомах 126
3.3.3.1. Влияние холестерина на пальмитат/Са -индуцируемую пермеабилизацию липосом и митохондрий 128
3.3.3.2. Влияние кардиолипина на формирование пальмитат/Са -активируемой поры в мембране 130
3.3.3.3. Влияние ненасыщенных жирных кислот на образование
пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах
3.3.4. Влияние модуляторов МРТ-поры на открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях печени крыс 135
3.3.5. Заключение 137
3.4. Физиологическая значимость митохондриальной поры, индуцируемой жирными кислотами и Са 138
3.4.1. Участие пальмитат/Са -индуцируемой поры в апоптотической клеточной гибели 139
9+
3.4.1.1. Открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры приводит к выбросу из митохондрий проапоптотических белков 139
3.4.1.2. Содержание насыщенных жирных кислот в клеточных мембранах выше в клетках, чувствительных к фактору некроза опухолей 141
3.4.1.3. Открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях печени зависит от возраста животного 142
3.4.2. Пальмитат/Са -индуцируемая пора как неспецифическая система выброса ионов Са из митохондрий 143
3.4.2.1. Липидная пора как система выброса Са в условиях добавленной пальмитиновой кислоты 144
3.4.2.2. Липидная пора как система выброса Са (Sr ) при активации фосфолипазы Аг 148
3.4.2.3. Участие поры, индуцируемой жирными кислотами и Sr , в механизме обратимого Sr -индуцированного выброса ионов из митохондрий в условиях гипотонии...
3.4.2.4. Механизм рециклизации ионов Са (Sr ) через митохондриальную
мембрану при открытии липидной поры, индуцируемой жирными кислотами 156
3.4.3. Возможная роль липидной поры в деградации нервных клеток 160
3.4.4. Заключение 167
3.5. Участие фосфолипазы А внешней мембраны Escherichia coli в процессе трансформации бактериальных клеток 168
3.5.1. Взаимодействие фосфолипазы А внешней мембраныЕ.coli с ингибиторами эукариотических фосфолипаз Аг 170
3.5.2. Влияние ингибиторов фосфолипаз Аг на рост клеточной биомассы E.coli...\12
3.5.3. Ингибиторы фосфолипаз Аг подавляют трансформацию Е. coli 172
3.5.4. Заключение 175
Заключение 176
Выводы 182
Список литературы
