Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы. Методы генотипирования вирусов 10
2.1 Уникальные методы генотипирования РНК-содержащих вирусов 11
2.1.1. Олигонуклеотидный метод "отпечатков пальцев" 11
2.1.2. Анализ полиморфизма длин геномных сегментов. (Электрофоретипирование) 13
2.2. Методы генотипирования ДНК- и РНК-содержащих вирусов 15
2.2.1. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот 15
2.2.2. Иммуноферментный анализ ДНК 16
2.2.3. Анализ с помощью РНКазы А 17
2.2.4. Гетеродуплексный анализ 19
2.2.4.1. Анализ подвижности гетеродуплексов 19
2.2.4.2. Анализ подвижности гетеродуплексов с меченым зондом 20
2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК 22
2.2.6. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 24
2.2.6.1. Классический ПДРФ анализ 24
2.2.6.2. ПЦР-ПДРФ анализ 27
2.2.6.3. ОТ-ПЦР-ПДРФ анализ 29
2.2.6.4. ДПЦР-ПДРФ анализ 30
2.2.6.5. Филогенетический анализ данных ПДРФ 31
2.2.6.6. Саузерн-блот анализ 32
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности вирусных геномов 32
2.2.7.1. Методы секвенирования 32
2.2.7.2. Стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК 34
2.2.7.3. Применение секвенирования для генотипирования вирусов 36
2.2.8. Генотипирование смешанных инфекций 38
2.3. Генотипирование поксвирусов 40
2.3.1. ПДРФ анализ ДНК ортопоксвирусов 40
2.3.2. ПЦР-ПДРФ анализ ортопоксвирусов 43
2.3.3. ПЦР методы анализа ДНК ортопоксвирусов 50
2.3.4. Методы молекулярной гибридизации ортопоксвирусов 52
2.3.5. ПДРФ анализ ДНК поксвирусов 53
2.3.6. Определение нуклеотидных последовательностей поксвирусов 55
2.4. Заключение 57
3. Материалы и методы 59
3.1. Материалы 59
3.2. Выделение ДНК вируса натуральной оспы 66
3.2.1. Вьщеление ДНК вируса натуральной оспы, культивированного в культуре клеток Vera 66
3.2.2. Вьщеление ДНК вируса натуральной оспы, культивированного наХАО КЭ 67
3.3. Олигонуклеотидные праймеры для ДПЦР 68
3.3.1. Олигонуклеотидные праймеры для получения музеев ампликонов и клонотек фрагментов ДНК ВНО 68
3.3.2. Олигонуклеотидные праймеры для ПДРФ-ДПЦР анализа 69
3.4. Длинная полимеразная цепная реакция (ДПЦР) 72
3.5. Получение рекомбинантных плазмид 72
3.6. Приготовление компетентных клеток E.coli 73
3.7. Трансформация компетентных клеток E.coli 73
3.8. Вьщеление плазмидной ДНК 73
3.9. ДПЦР-ПДРФ анализ 74
3.10. Филогенетический анализ данных ДПЦР-ПДРФ 74
4. Результаты 75
4.1. Получение и характеризация препаратов полноразмерных ДНК ВНО 75
4.2. Создание и характеризация музея коллекций ампликонов ДНК ВНО 75
4.2.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР 75
4.2.2. Получение и характеризация коллекций ампликонов ДНК ВНО 76
4.2.3. Создание музея коллекций ампликонов ДНК ВНО 78
4.3. Создание клонотек фрагментов ДНК полных геномов штаммов вируса натуральной оспы 79
4.3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР 80
4.3.2. Синтез ампликонов ДНК ВНО для получения рекомбинантных плазмид 80
4.3.3. Получение рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО 80
4.3.4. Создание музея клонотек фрагментов ДНК ВНО 82
4.4. Изучение вариабельности геномов разных штаммов ВНО при использовании ДПЦР-ПДРФ анализа 84
4.4.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР 84
4.4.2. Получение ампликонов для ДПЦР-ПДРФ анализа Российской коллекции ДНК ВНО 85
4.4.3. Получение рестрикционных профилей ампликонов 86
4.4.4. Филогенетический анализ ДПЦР-ПДРФ базы данных штаммов ВНО Российской коллекции 88
4.4.5. Филогенетическое сравнение геномов штаммов ВНО Российской коллекции и коллекции США 97
Обсуждение результатов 108
Выводы 119
