Введение
2 Обзор литературы 7
2.1 Формирование клональных репертуаров Т-лимфоцитов 7
2.1.1 Созревание Т-лимфоцитов в тимусе и перестройка TCR 7
2.1.2 Селекция Т-лимфоцитов 10
2.2 Анализ клональных репертуаров Т-лимфоцитов с помощью высокопроизводительного секвенирования 12
2.2.1 Клональные репертуари функционально различных субпопуляций Т-клеток 14
2.3 Специфичность и кросс-реактивность TCR 17
2.4 Нарушение иммунологической толерантности 21
2.4.1 Элиминация клонов аутореактивных Т-лимфоцитов 21
2.4.2 Активность регуляторних Т-клеток 24
2.4.3 Периферическая анергия Т-лимфоцитов 26
2.5 Спондилоартропатии 29
2.5.1 Симптоматика и патогенез 29
2.5.2 Генетические факторы, связанные с развитием СпА 31
2.5.3 Этиология и патогенез СпА 33
2.6 Терапия аутоиммунных заболеваний 37
3 Цели и задачи 41
4 Экспериментальная часть 42
4.1 Материалы и реактивы 42
4.1.1 Реактивы 42
4.1.2 Выборка пациентов с АС и ПсА 42
4.1.3 Характеристика пациентов с АС, перенесших аутологичную ТГСК 43
4.1.4 ТГСК 43
4.1.5 Здоровые доноры 44
4.2 Лабораторное оборудование 45
4.3 Методы исследования 46
4.3.1 Выделение клеток мононуклеарной фракции из образцов периферической крови и синовиальной жидкости доноров 46
4.3.2 Выделение субпопуляций Т-клеток из мононуклеарной фракции периферической крови и синовиальной жидкости доноров 47
4.3.3 Выделение РНК из различных субпопуляций лимфоцитов 47
4.3.4 Подготовка кДНК библиотек TCR и секвенирование 47
4.3.5 Обработка результатов секвенирования кДНК библиотек TCR 48
4.3.6 Подготовка библиотек кДНК для генотипирования по HLA-локусу 49
4.3.7 Обработка результатов секвенирования HLA 50
5 Результаты и обсуждение 51
5.1 Стратегия реконструкции клональных репертуаров Т-лимфоцитов 51
5.1.1 Получение библиотек кДНК р-цепей TCR 51
5.1.2 Восстановление индивидуальных репертуаров Т-лимфоцитов 53
5.2 Анализ клональных репертуаров Т-лимфоцитов периферической крови пациентов с анкилозирующим спондилитом 56
5.2.1 Характеристика общего клонального разнообразия 56
5.2.2 Исследование клональных экспансий, характерных для репертуаров пациентов с анкилозирующим спондилитом 57
5.2.3 Поиск АС-ассоциированных клонотипов Т-лимфоцитов с помощью оценки вероятности генерации TCR 59
5.2.4 Присутствие и численность АС-ассоциированных клонотипов в периферической крови пациентов с АС и здоровых HLA-B 27+ доноров 62
5.3 Анализ клональных репертуаров синовиальной жидкости пациентов со спондилоартропатиями 65
5.3.1 Характеристика разнообразия и олигоклональности репертуаров Т-клеток синовиальной жид кости 65
5.3.2 Исследование клональных экспансий Т-лимфоцитов синовиальной жидкости 66
5.3.3 Поиск клонов с известной специфичностью в репертуарах Т-клеток периферической крови и синовиальной жидкости пациентов с СпА 68
5.3.4 Идентификация клонотипов, обогащенных в очаге воспаления и ассоциированных с АС 71
5.3.5 Присутствие АС-ассоциированных клонотипов в очагах воспаления пациентов с другими спондилоартропатиями 73
5.3.6 Характеристика АС-ассоциированных клонотипов TCRP 75
5.3.7 Определение парной альфа-цепи АС-ассоциированных клонотипов TCRP .76
5.4 Исследование клональных репертуаров Т-лимфоцитов у пациентов с АС после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток крови 79
5.4.1 Динамика восстановления клонального репертуара Т-лимфоцитов 79
5.4.2 Эффект ТГСК в отношении первоначального репертуара Т-лимфоцитов 80
5.4.3 Структура клонального репертуара пациентов через два года после ТГСК 83
6 Заключение 87
7 Выводы 88
8 Благодарности 89
9 Список литературы 100
Список сокращений 101
11 Приложения 102
11.1 Приложение А 102
