Введение
1. Глава 1. Обзор литературы. 9
1.1 История изучения активного центра медьсодержащих оксидаз и их представителя - лакказы 9
1.2 Подходы к изучению структуры активного центра 14
1.3 Условия получения кристаллов лакказ из различных источников 18
1.4 Исследование структур лакказ методом рентгеноструктурного анализа 21
Ход полипептидной цепи лакказ 24
Структура активного центра лакказ на основе данных РСА. 27
Особенности пространственного строения центра ТІ 28
Особенности пространственного строения Т2/ТЗ-кластера 35
1.5 Механизм действия фермента 39
Внутримолекулярный перенос электрона 40
1.6 Заключение 47
2. Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1 Материалы и объекты исследования 48
2.2 Культивирование Coriolus hirsutus - продуцента лакказы 48
2.3 Выделение и очистка лакказы 49
2.3.1 Очистка фермента методом ВЭЖХ 50
2.3.2 Очистка фермента методом изоэлектрофокусирования 50
2.3.3 Очистка фермента методом препаративного электрофореза.. 51
2.4 Контроль гомогенности препаратов 52
2.5 Метод определения активности лакказы 52
2.5.1 Изучение влияния температурно-фазового перехода на каталитическую активность лакказы 52
2.6 Установление аминокислотной последовательности лакказы из Coriolus hirsutus 072 53
2.6.1 Установление аминокислотной последовательности участка N-конца лакказы С. hirsutus 53
2.6.2 Клонирование и секвенирование кДНК лакказы из С. hirsutus 54
2.6.2.1 Получение препарата РНК из С. hirsutus 54
2.6.2.2 Получение препарата кДНК лакказы из С. hirsutus 55
2.7 Определение степени сходства лакказы из С. hirsutus с известными последовательностями лакказ 58
2.8 Спектральные измерения 59
2.8.1 Регистрация оптических спектров лакказы 59
2.8.2 Регистрация ЭПР-спектров лакказы 59
2.9 Измерение малоуглового рентгеновского рассеяния 60
2.10 Получение кристаллов лакказы 60
2.11 Сбор диффракционных данных и их обработка 61
2.12 Аналитические методы 62
2.12.1 Определение концентрации белка 62
2.12.2 Определение количества ионов металлов в белке 62
2.12.2.1 Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой.62
2.12.2.2 Атомно-адсорбционная спектрометрия 62
2.12.2.3 Спектрофотометрическое определение ионов меди 63
3. Глава 3. Результаты и их обсуждение. 64
3.1 Очистка, характеристика фермента 64
3.2 Изучение влияния температурно-фазовых переходов на активность и структуру лакказы из Coriolus hirsutus 71
3.3 Определение аминокислотной последовательности лакказы из Coriolus hirsutus 072 82
3.4 Определение пространственной структуры лакказы методом рентгеноструктурного анализа 88
3.4.1 Подбор и оптимизация условий кристаллизации лакказы из Coriolus hirsutus 88
3.4.2 Рентгеновский эксперимент 93
3.4.3 Решение пространственной структуры лакказы методом молекулярного замещения 94
3.4.4 Кристаллическая структура. Уточнение и корректировка модели фермента 94
3.4.5 Описание вторичной структуры 99
3.4.6 Пространственная структура активного центра. Координация медных ионов 106
3.5 Предполагаемый механизм действия фермента 120
Выводы 125
Список цитируемой литературы 126
