Введение
1. Биосинтез рибофлавина и его производных у бактерий 10
1.1. Пути биосинтеза рибофлавина у бактерий 10
1.1.1. ГТФ-циклогидролаза II 12
1.1.2. Редуктаза и дезаминаза 13
1.1.3. Дефосфорилирование 5-амино-6-(рибитиламино)-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион-5-фосфата 13
1.1.4. 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтаза 14
1.1.5. Люмазинсинта 14
1.1.6. Рибофлавинсинтаза 15
1.1.7. Биосинтез флавиновых нуклеотидов, ФМН и ФАД 16
1.2. Гены биосинтеза рибофлавина и его производных 17
2. Регуляция экспрессии генов посредством рибопереключателей у бактерий 22
2.1. Разнообразие рибопереключателей у бактерий 23
2.2. Аналоги лигандов рибопереключателей как антимикробные соединения 27
2.3. Механизмы действия рибопереключателей 29
2.3.1. Роль Rho-фактора в регуляции экспрессии генов с участием рибопереключателей 33
2.4. Структурная организация рибопереключателей 35
2.5. ФМН-связывающие рибопереключатели 38
2.5.1. Пространственная структура rfn-элемента 39
2.5.2. Механизмы действия ФМН-связывающих рибопереключателей 41
2.5.2.1. Регуляция генов, вовлеченных в биосинтез рибофлавина 41
2.5.2.2. Регуляция генов, вовлеченных в транспорт рибофлавина 43
Материалы и методы 46
3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 46
3.2. Состав питательных сред, используемых для выращивания бактерий 47
3.3. Выделение хромосомной ДНК из бактерий B.subtilis 48
3.4. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 49
3.5. Трансформация бактерий 49
3.5.1. Трансформация E.coli 49
3.5.2. Трансформация B.subtilis 49
3.6. Конструирование транскрипционных фьюзов ribP1-3-lacZ в гене amyE хромосомы B.subtilis 50
3.7. Конструирование транскрипционных фьюзов, локализованных в области rib-оперона B.subtilis. 51
3.8. Сайт-направленный мутагенез 52
3.9. Конструирование транскрипционных и трансляционных фьюзов ypaA-lacZ в гене amyE хромосомы B.subtilis 53
3.10. Конструирование транскрипционных фьюзов ribB-lacZ 54
3.11. Определение активности -галактозидазы 55
3.11.1. В культуре клеток E.сoli 55
3.11.2. В культуре клеток B.subtilis 55
3.12. Выделение суммарной РНК из бактериальных клеток 56
3.13. Определение старта транскрипции 57
3.14. Транскрипция in vitro 58
3.15. Транскрипция in vitro на твердой фазе 58
3.15.1. Определение расположения Rho-независимого терминатора транскрипции гена ypaA B.subtilis 59
3.15.2. Транскрипция лидерной области гена ribB E.coli в очищенной системе in vitro 60
3.16. Анализ формирования 30S-инициаторного комплекса на мРНК (тоупринт-анализ) 61
3.17. Анализ вторичной структуры РНК («In-line probing») 62
3.18. Количественная ПЦР (RT-qPCR) 63
Результаты 66
4. Изучение структурно-функциональной организации внутренних промоторов рибофлавинового оперона B. subtilis 66
4.1. Определение старта транскрипции внутренних промоторов Р2 и Р3 rib-оперона 67
4.2. Оценка силы промоторов rib-оперона 70
4.3. Определение уровня транскрипции генов ribB, ribA и ribT в составе rib-оперона 71
4.4. Изучение уровня транскрипции генов rib-оперона с помощью RT-qPCR 73
5. Исследование регуляции экспрессии гена ypaA B.subtilis 80
5.1. Определение структуры промотора гена ypaA B.subtilis 81
5.2. Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма B. subtilis RKH25 и его изогенного варианта B. subtilis RKH25-C1 82
5.3. Влияние ФМН на формирование 30S-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена ypaA B.subtilis 86
5.4. Транскрипция in vitro гена ypaA на твердой фазе 88
5.5. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма B. subtilis RibB110 90
5.6. Транскрипция лидерной мРНК гена ypaA дикого типа и ее мутантных вариантов в системе in vitro 94
5.7. Изучение вторичной структуры лидерной мРНК гена ypaA методом гидролиза («In line probing») 96
6. Исследование регуляции экспрессии гена ribB E.coli 102
6.1. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ribB-LacZ в клетках штамма E.coli AM4002 102
6.2. Определение доли полноразмерного транскрипта гена ribB методом «достройки праймера» 106
6.3. Изучение транскрипции гена ribB на фоне ингибирования Rho-фактора
методом RT-qPCR 107
6.4. Влияние Rho-фактора на элонгацию транскрипции гена ribB в
очищенной системе in vitro 109
Обсуждение 114
Выводы 121
Список литературы 122
