Введение
2. Обзор литературы
2.1. Введение. Антимикробные пептиды как факторы врожденного иммунитета 7
2.2. -Шпилечные АМП, стабилизированные одной дисульфидной связью 11
Бактенецины 11
Тигеринины и ранациклины 13
Танатин 15
Лактоферрицины 18
Ареницины 21
2.3. -Шпилечные АМП, стабилизированные двумя дисульфидными связями 25
Протегрины 25
Гомезин 29
Тахиплезины и полифемузины 31
Андроктонин 34
2.4 . -Шпилечные АМП, стабилизированные тремя дисульфидными связями
-Дефенсины 35
-Дефенсины 39
2.5. -Шпилечные АМП, стабилизированные четырьмя дисульфидными связями 40
Гепцидины 40
2.6. Заключение 43
3. Материалы и методы 46
3.1. Оборудование 46
3.2. Реактивы и расходные материалы 47
3.3. Программное обеспечение 48
3.4. Создание последовательностей, кодирующих антимикробные пептиды
3.4.1. Определение концентрации олигонуклеотидов 49
3.4.2. Сборка фрагментов ДНК 49
3.5. Создание генно-инженерных конструкций 50
3.5.1. Приготовление электрокомпетентных клеток 51
3.5.2. Трансформация клеток E.coli методом электропорации 51
3.5.3. Выделение плазмидной ДНК 51
3.5.4. Рестрикция фрагментов ДНК и плазмидных векторов 51
3.5.5. Лигазная реакция 52
3.5.6. Приготовление химически компетентных клеток E. coli 52
3.5.7. Трансформация методом теплового шока 52
3.5.8. ПЦР-анализ клонов 52
3.5.9. Электрофорез в агарозном геле 53
3.5.10. Секвенирование ДНК 53
3.6. Сайт-направленный мутагенез 53
3.6.1. Инвертированная ПЦР 54
3.6.2. Введение дополнительных остатков и делеций 56
3.7. Гетерологическая экспрессия антимикробных пептидов в составе гибридных белков 57
3.7.1. Оптимизация условий экспрессии 57
3.7.2. Гель-электрофорез в полиакриламидном геле 57
3.7.3. Препаративная экспрессия антимикробных пептидов 58
3.8. Выделение и очистка рекомбинантных антимикробных пептидов 59
3.8.1. Выделение клеточного белка 59
3.8.2. Металлохелатная хроматография з
3.8.3. Диализ 60
3.8.4. Расщепление гибридного белка 60
3.8.5. Циклизация N-концевого остатка глутамина 60
3.8.6. Селективное осаждение белков 60
3.8.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография 61
3.9. Качественный и количественный анализ очищенных пептидов 61
3.10. Контроль корректного замыкания дисульфидных связей в пептидах 62
3.11. Антимикробная активность 62
3.12. Гемолитическая активность 63
3.13. Цитотоксичность 63
3.14. ДНК-связывающая активность 64
3.15. Измерение проницаемости наружной и цитоплазматической мембран E. coli в реальном времени 64
3.16. Измерение проницаемости цитоплазматической мембраны S. aureus в реальном времени 65
3.17. Измерение стабильности пептидов в сыворотке крови 66
3.18. Измерение синергических эффектов при совместном действии антимикробных пептидов 66
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Структурно-функциональное исследование ареницина-1 67
4.1.1. Изучение полноразмерных аналогов ареницина-1 68
4.1.2. Изучение укороченных аналогов ареницина-1 80
4.1.3. Сравнительное изучение биологических свойств ареницина-1 и его аналогов 4.2. Структурно-функциональное исследование тахиплезина-1 88
4.3. Получение рекомбинантных аналогов антимикробных пептидов и исследование их совместного действия на бактерии 5. Заключение 106
6. Выводы 108
