Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1 Гормон роста и его секретагоги 11
1.1.1 Физиологическое значение гормона роста 12
1.1.2 Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста 13
1.1.3 Грелин и его рецептор 14
1.1.4 Рилизинг-пептиды гормона роста 15
1.2 Особенности метаболизма химически-модифицированных и синтетических белков и пептидов 19
1.2.1 Замена аминокислот (использование D-, - и ненатуральных аминокислот) 20
1.2.2 Замена пептидной связи (псевдопептиды) 29
1.2.3 Изменение N- и C-концевых частей молекулы 36
1.3 Методы изучения метаболизма соединений пептидной природы 40
1.3.1 Биологические модели изучения метаболизма 40
1.3.2 Аналитические подходы идентификации метаболитов 42
1.4 Методы определения GHRP и их метаболитов в допинг-контроле 45
1.4.1 Хроматомасс-спектрометрические методы 45
1.4.2 Метод конкурирующего связывания лигандов с рецептором грелина 54
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1 Химические реактивы и материалы 56
2.2 Основное оборудование 57
2.3 Вспомогательное оборудование 58
2.4 Методика эксперимента 58
2.4.1 наноВЭЖХ-МСВР анализ GHRP и их метаболитов 58
2.4.2 СВЭЖХ-МС/МС анализ GHRP и их метаболитов 60
2.4.3 Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro 60
2.4.4 Пробоподготовка проб мочи методом ТФЭ 63
2.4.5 Пробоподготовка проб сыворотки крови 65
2.4.6 Изучение метаболитов GHRP в образцах мочи и сыворотки крови после приема препаратов здоровыми добровольцами 66
Глава 3. Результаты и обсуждения 69
3.1 Сравнение различных in vitro и in vivo моделей метаболизма синтетических допинговых соединений пептидной природы 69
3.1.1 Протеолитические ферменты 69
3.1.2 Сыворотка человеческой крови 78
3.1.3 Субклеточные фракции 84
3.1.4 Выбор оптимальной in vitro модели моделирования процессов биотрансформации пептидных соединений в организме человека 94
3.1.5 Идентификация in vivo метаболитов GHRP в моче человека после назального приема пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина и ипаморелина 95
3.2 Разработка и валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС 101
3.2.1 Выбор сорбента для ТФЭ 101
3.2.2 Выбор способа доведения рН 105
3.2.3 Валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС 107
3.3 Апробация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС 112
3.3.1 Количественная оценка наиболее интенсивных и долгоживущих метаболитов GHRP в образцах мочи 112
3.3.2 Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформацию соединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назального приема GHRP-6 115
Заключение 125
Выводы 128
Благодарности 130
Список условных обозначений и сокращений 131
Список литературы 135
