Введение
ГЛАВА 1. Конструирование искусственных никующих эндонуклеаз и их использование в генетической инженерии (Обзор литературы) 11
1.1. Встречающиеся в природе эндонуклеазы рестрикции и никующие эндонуклеазы 11
1.2. Конструирование искусственных никующих эндонуклеаз 14
1.2.1. Получение никующих эндонуклеаз путем нарушения димеризационного интерфейса эндонуклеаз рестрикции 14
1.2.2. Получение никующих эндонуклеаз на основе гомодимерных эндонуклеаз рестрикции, содержащих один каталитический центр в каждой субъединице 15
1.2.3. Получение никующих эндонуклеаз путем инактивации одного из каталитических центров эндонуклеаз рестрикции 16
1.2.4. Получение никующих эндонуклеаз в результате случайного мутагенеза генов эндонуклеаз рестрикции 20
1.2.5. Получение никующих эндонуклеаз из «хоуминг»-эндонуклеаз 23
1.3. Стимулирование матрично-независимого синтеза ДНК никующими эндонуклеазами 25
1.4. Практическое использование сайт-специфических никующих эндонуклеаз 26
1.4.1. Изотермическая амплификация ДНК 26
1.4.2. Способы детекции ДНК с использованием никующих эндонуклеаз 28
1.4.3. Перемещение олигодезоксирибонуклеотида 30
1.4.4. Клонирование фрагментов ДНК без использования ДНК-лигаз 31
1.4.5. Детекция РНК с использованием никующих эндонуклеаз 32
1.4.6. Введение модификаций во внутренние участки ДНК с использованием никующих эндонуклеаз 33
1.4.7. Использование никующих эндонуклеаз в секвенировании ДНК 36
1.4.8. Использование никующих эндонуклеаз при анализе профиля метилирования 38
1.5. Изменение активности никующих эндонуклеаз с помошью псевдокомплементарных ПНК 39
1.6. Высокоспецифичные эндонуклеазы 41
1.6.1. Мегануклеазы 41
1.6.2. Эндонуклеазы с мотивом «цинковые пальцы» 44
1.6.3. TALE-нуклеазы 46
1.6.4. Нуклеазы, связанные с триплекс-образующим олигонуклеотидом (TFO нуклеазы) 48
1.6.5. Эндонуклеазы системы CRISPR/Cas 50
1.6.6. Нуклеазы, узнающие «флэп»-структуру в ДНК 53
1.7. Создание эндонуклеаз с регулируемой активностью 54
ГЛАВА 2. Гетеродимерная эндонуклеаза рестрикции bspd6i и конъюгаты гомодимерной эндонуклеазы рестрикции SSOII солигодезоксирибонуклеотидами: особенности взаимодействия с ДНК (Результаты и их обсуждение) 58
2.1. Характеристика объектов исследования 58
2.2. Изучение свойств эндонуклеазы рестрикции BspD6I и особенностей ее взаимодействия с ДНК 61
2.2.1. Определение угла изгиба ДНК, индуцируемого никующей эндонуклеазой BspD6I 62
2.2.2. Характеристика свойств эндонуклеазы рестрикции BspD6I с помощью немодифицированных ДНК-дуплексов 68
2.2.3. Взаимодействие эндонуклеазы рестрикции BspD6I с метилированными ДНК-дуплексами 86
2.2.4. Взаимодействие эндонуклеазы рестрикции BspD6I с азобензолсодержащими ДНК-дуплексами 90
2.3. Разработка подходов к регулированию активности никующей эндонуклеазы BspD6I
с использованием модифицированных ДНК-дуплексов 100
2.3.1. Подбор оптимальной структуры негидролизуемых аналогов субстрата Nt.BspD6I 102
2.3.2. Изучение активности Nt.BspD6I в присутствии азобензолсодержащих дуплексов при облучении светом 107
з
2.3.3. Использование триэтиленгликольсодержащего дуплекса для регулирования активности Nt.BspD6I в зависимости от температуры 110
2.4. Изучение свойств конъюгатов гомодимерной эндонуклеазы рестрикции SsoII с ДНК-фрагментами 115
2.4.1. Выбор положения модификации эндонуклеазы рестрикции SsoII олигонуклеотидом 118
2.4.2. Выбор структуры олигонуклеотида для ковалентного присоединения к эндонуклеазе рестрикции SsoII 119
2.4.3. Зависимость устойчивости ДНК-дуплексов от температуры 122
2.4.4. Модификация мутантной формы R.SsoII(2CS/S171C) олигонуклеотидами, содержащими азобензольную вставку 126
2.4.5. Гидролиз ДНК-субстрата конъюгатами R.SsoII(2CS/S171C) с азобензол-содержащими олигонуклеотидами в зависимости от облучения УФ-светом 130
2.4.6. Гидролиз ДНК-субстрата конъюгатами R.SsoII(2CS/S171C) с олигонуклеотидами в зависимости от температуры 133
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 137
3.1. Реактивы и материалы 137
3.2. Приборы и методы 140
3.3. Общие методики 142
3.3.1. Методики, использованные при определении угла изгиба ДНК, индуцированного связыванием Nt.BspD6I 142
3.3.2. Анализ связывания и гидролиза никующей эндонуклеазой BspD6I и эндонуклеазой рестрикции BspD6I синтетических ДНК-дуплексов 145
3.3.3. Анализ связывания никующей эндонуклеазой BspD6I синтетических ДНК дуплексов методом акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре 146
3.3.4. Регулирование активности никующей эндонуклеазы BspD6I с помощью облучения светом и изменения температуры реакции 147
3.3.5. Выделение препаратов R.SsoII(2CS/S171C) методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе 148
3.3.6. Получение конъюгатов эндонуклеазы рестрикции SsoII(2CS/S171C) с олигонуклеотидами 149
3.3.7. Изучение активности эндонуклеазы рестрикции SsoII(2CS/S171C) в зависимости от облучения светом и изменения температуры реакции 150
Выводы 151
Список литературы 152
