Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. G-белки и ГТФ-азы трансляции 8
1.1.1. Общие свойства G-белков 8
1.1.1.1. Структура GTP связывающего центра (G домена) 8
1.1.2. Механизм активации гидролиза GTP 11
1.1.3. Цикл работы ГТФ-азы 13
1.2. Факторы трансляции 14
1.2.1.EF-TU 16
1.2.2. EF-G 18
1.2.3. IF2 20
1.2.4.RF3 22
1.2.5. Роль гидролиза GTP и освобождения Р( в функционировании факторов трансляции 25
1.2.6. Активация ГТФ-азы факторов трансляции при взаимодействии с рибосомой 27
1.3. Заключение 29
2. Транслокация и элонгационный фактор G 31
2.1. Механизм действия EF-G и гидролиз GTP в процессе транслокации 31
2.2. Расположение EF-G на рибосоме 37
2.3. Структурные изменения EF-G и рибосомы в процессе транслокации 40
2.4. Роль спирали 34 в транслокации 43
3. Результаты и обсуждение 46
3. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой 46
3.1. Места введения фотоаффинного реагента в EF-G 46
3.2. Модификация фотоаффинным реагентом 46
3.3. Проверка функциональной активности модифицированного фактора 49
3.4. Формирование рибосомных комплексов с модифицированным EF-G 50
3.5. Анализ сшивок радиоактивно меченного EF-G 51
3.6. Применение иммунологических методов для анализа продуктов фотохимического сшивания 52
3.7. Заключение 54
4. Мутации в спирали 34 16S рРНК 55
4.1. Выбор мест введения мутаций в 16S рРНК 55
4.2. Введение мутаций в 16S рРНК (мутагенез) 57
4.3. А7 штамм для экспрессии мутантных рРНК (МС250) 58
4.4. Измерение времени удвоения клеток 59
4.5. Выделение рибосом и проблема диссоциации рибосом 60
4.6. RT-анализ наличия мутаций в рРНК и определение чистоты популяции рибосом 61
4.7. Зависимость степени диссоциации рибосом от концентрации Мд2+ 62
4.8. Инициация и зависимость эффективности инициации от концентрации Мд2+. 64
4.8.1. Инициация при 7 мМ Мд2+ 64
4.8.2. Зависимость выхода образования инициаторного комплекса от концентрации Мд2+ 65
4.9. Эффективность связывания аа-тРНК с А участком рибосомы и образования претранслокационного комплекса 66
4.10. Связывание с А участком рибосомы аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном 67
4.11. Влияние мутаций на весь процесс функционирования EF-G в процессе транслокации (стационарная кинетика) 70
4.12. Метод престационарнои кинетики (остановленного потока) и оборудование для него 75
4.12.1. Устройство установки для проведения кинетических экспериментов методом остановленного потока 75
4.12.2. Профлавин - флуоресцентная метка втРНКРЇ1е 76
4.13. Престационарная кинетика связывания аа-тРНК с А участком рибосомы 77
4.14. Престационарная кинетика элементарного акта транслокации 80
4.15 Определение точности трансляции in vivo 84
4.16. Пробинг 16S рРНК 89
4.16.1. Химический пробинг всей последовательности 16S рРНК 90
4.16.2. Пробинг 16S рРНК в инициаторном комплексе 92
4.17 Заключение 97
5. Протонированные основания в рРНК 99
5.1. Роль протонированных нуклеотидов 23S рРНК в пептидилтрансферазной реакции и катализе гидролиза GTP на EF-G 99
5.2. Боргидридный метод определения заряженных оснований в РНК 100
5.3. Пара CH+2575-U2511 101
5.4. НуклеотидА1528 103
5.4. Заключение 104
6. Материалы и методы 106
6.1. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой 106
6.1.1. Создание конструкции для экспресии гена EF-G 106
6.2. Выделение и очистка EF-G 106
6.3. Модификация EF-G фотоаффинным реагентом 107
6.4. Формирование комплекса EF-G с рибосомой 108
6.4.1. Посттранслокационный комплекс с тиострептоном 108
6.4.2. Фосфорилирование EF-G в рибосомном комплексе 108
6.5. Разделение модифицированных компонентов рибосомы 108
6.6. Анализ продуктов фотохимической модификации с помощью антител 109
7. Мутации в спирали 3416S рРНК 110
7.1. Трансформация клеток Escherichia coli 110
7.1.1. Получение компетентных клеток 110
7.1.2. Трансформация 110
7.2. Введение мутации в рРНК (мутагенез по методу Кункеля) 111
7.3. Создание А7 штаммов МС250 и AVS69009, несущих мутированный рибосомный оперон на плазмиде pSTLxxxx 112
7.4. Измерение времени удвоения клеток 113
7.5. Стандартная методика выделения рибосом 113
7.6. Выделение рибосом при повышенной концентрации Мд2+ 115
7.7. Проверка наличия мутации врибосомной РНК (RT анализ) 115
7.7.1. Выделение рибосомной РНК 115
7.7.2. Реакция обратной транскрипции 116
7.8. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастиц от концентрации Мд2+ 117
7.9. Образование инициаторных комплексов 117
7.9.1. Стандартные условия (7 мМ Мд2+) 117
7.9.2. Формирование инициаторных комплексов при различной концентрации Мд2+ 117
7.10. Определение константы скорости траслокации в единичном акте транслокации (престационарная кинетика, метод остановленного потока) 117
7.10.1. Формирование претраслокационного комплекса с профлавинированной TPHKPhe 117
7.10.2. Получение кинетических кривых (метод остановленного потока) 118
7.11. Определение каталитической константы в многократном акте транслокации (стационарная кинетика) 119
7.11.1. Формирование претраслокационного комплекса 119
7.11.2. Получение кинетических кривых 119
7.12. Анализ образования дипептида 120
7.13. Кинетика связывания тройного комплекса EF-Tu(His)»GTP«[14C]Phe-TPHKPhePrf с А участком рибосомы (престационарная кинетика, метод остановленного потока) 120
7.13.1. Формирование тройного комплекса в профлавинированной TPHKPhe 120
7.13.2. Формирование инициаторного комплекса 121
7.13.3. Получение кинетических кривых (stopped flow) 121
7.14. Определение точности трасляции in vivo 121
7.14.1. Получение штаммов МС127, содержащих плазмиду pSTLxxxx 121
7.14.2. Определение активности р-галактозидазы 121
7.15. Химический пробинг рибосомных субчастиц, рибосом, рибосомных комплексов и анализ модификаций 122
7.15.1. Реактивы, растворы и буферы 122
7.15.2. Модификация DMS 123
7.15.3. Модификация кетоксалем 123
7.15.4. Модификация СМСТ 124
7.15.5. Выделение суммарной рибосомной РНК 124
7.15.6. Реакция обратной транскрипции 124
8. Протонированные основания в 23S рРНК 126
8.1. Модификация РНК боргидридом натрия 126
8.2. Реакция обратной транскрипции 127
Выводы 128
