Введение
Обзор литературы
1.1. Физико-химические свойства Т7РНКП, первичная и пространственная структура фермента 10
1.2. Транскрипционный цикл Т7РНКП 19
1.2.1. Взаимодействие с промотором 20
1.2.2. Связывание NTP и инициация транскрипции 34
1.2.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК 44
1.2.4. Неспецифические проявления активности Т7РНКП. Беспромоторные системы 55
1.2.5. Терминация транскрипции 59
1.3. Функциональные исследования 7РНКП. Роль отдельных аминокислотных остатков 72
1.2.5. Химическая модификация и ингибиторный анализ 73
1.2.6. Аффинная модификация 76
1.2.7. Исследование мутантных форм Т7РНКП 95
Материалы и методы
2.1. Реактивы, буферные растворы, плазмиды и ферментные препараты 114
2.2. Методики, использованные в работе 117
2.3. Расчет кинетических параметров реакций 131
2.4. Конформационные расчеты и построение пространственных моделей 135
Результаты и обсуждение 137
3.1. Аналоги нуклеотидов - субстраты и ингибиторы Т7РНКП 137
3.2. Необратимые ингибиторы Т7РНКП. Аффинная модификация фермента 145
3.3. Роль N-концевого домена и междоменной перемычки 158
3.3.1.Изучение ограниченного протеолиза Т7РНКП 158
3.3.2. Исследование мутантных форм Т7РНКП, содержащих замены аминокислотных остатков в области междоменной перемычки 160
3.3.3. Мутации по остатку Lys-98 171
3.4. Роль аминокислотной последовательности 563-571 в Т7РНКП 173
3.5. Исследование консервативного мотива В 179
3.5.1.Общая характеристика мотива В 179
3.5.2. Обоснование выбора вариантов аминокислотных замен 180
3.5.3. Мутации в N-концевой части мотива В 181
3.5.4. Мутации в С-концевой части мотива В 186
3.6. Уникальные свойства мутанта Tyr639Phe. «Двойной» и «тройной» мутанты.Л 96
3.6.1.Утилизация дезоксирибонуклеотидов мутантной формой Т7РНКП 196
3.6.2. Ошибки при транскрипции, свойственные «двойному» и «тройному» мутантам 204
3.6.3. Функционирование «двойного» мутанта Т7РНКП в режиме удлинения праймера 206
3.7. Взаимодействие Т7РНКП с модифицированными промоторами 212
3.8. Фотоаффинная модификация Т7РНКП. 5-[3-()-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензамидо)пропенил-1]-иТР (N3-TFBP-UTP) 223
Выводы 233
Благодарности 236
Список литературы 237
