Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Структурные полисахариды клеточных стенок растений 9
1.1. Строение пектина 11
1.1.1. Основная цепь пектина 11
1.1.2. Боковые цепи пектина 14
1.1.3. Неуглеводные заместители в пектине 15
Глава 2. Биодеградация пектина 17
2.1. Полигалактуроназы 18
2.1.1. Гены, кодирующие синтез полигалактуроназ 19
2.1.2. Структура и механизм действия полигалактуроназ 21
2.1.3. Биохимические свойства энгЬ-полигалактуроназ A. niger 24
2.2. Пектинэстеразы 26
2.2.1. Структура и механизм действия пектинэстераз 27
2.2.2. Влияние различных факторов на активность пектинэстераз 27
2.3. Пектин- и пектатлиазы 29
2.3.1. Структура и механизм действия пектин- и пектатлиаз 30
2.3.2. Биохимические свойства пектин- и пектатлиаз 33
Глава 3. Распространение в природе и использование пектиназ 37
Глава 4. Грибы рода Aspergillus 42
II. Экспериментальная часть
Глава 5. Объекты исследования и методика эксперимента 47
5.1. Материалы 47
5.1.1. Микроорганизмы и условия культивирования 47
5.1.2. Ферментные препараты 47
5.1.3. Субстраты и реактивы 48
5.2. Хроматографическое разделение препаратов и выделение ферментов 49
5.3. Определение концентрации белка 49
5.4. Определение биохимических характеристик ферментов 51
5.5. Методы определения активности ферментов 51
5.5.1. Определение активности к полисахаридным субстратам 51
5.5.2. Определение активности к л-нитрофенильным производным Сахаров 52
5.5.3. Определение пектинлиазной активности 53
5.5.4. Определение пектинэстеразной активности 54
5.5.5. Вискозиметрический метод определения общей пектиназной активности... 55
5.6. Определение кинетических параметров действия ферментов 56
5.7. Изучение зависимостей активности ферментов отрН и температуры 56
5.8. Изучение рН- и термостабильности ферментов 57
5.9. Исследование изменения ММР продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов 57
5.10. Проведение гидролиза пектинов под действием ферментов 57
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 58
5.12. Оценка способности ферментов к осветлению яблочного сока 58
5.13. Оценка способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов... 59
III. Результаты и их обсуждение
Глава 6. Поиск и создание продуцентов пектиназ 60
6.1. Мутагенез и селекция гриба A. japonicus 60
6.2. Сравнение ферментного состава препаратов на основе исходного и мутантного штаммов A. japonicus 66
6.3. Мутагенез и селекция гриба A. foetidus 72
Глава 7. Выделение гомогенных пектиназ 78
7.1. Выделение пектиназ A. japonicus 78
7.1.1. Очистка полигалактуроназы 81
7.1.2. Очистка пектинэстеразы 82
7.1.3. Очистка пектинлиазы 82
7.2. Выделение пектиназ A. foetidus 84
7.2.1. Очистка полигалактуроназы 85
7.2.2. Очистка пектинэстеразы 86
7.3. Анализ препаратов, niger н выделение основных пектиназ 87
7.3.1. Субстратная специфичность препаратов A niger 87
7.3.2. Аналитическое фракционирование препарата/1. niger 88
7.3.3. Препаративное разделение препарата/1. niger 90
7.3.4. Очистка полигалактуроназ 90
7.3.5. Очистка пектинэстеразы 93
7.3.6. Очистка пектинлиазы 94
Глава 8. Идентификация пектиназ с помощью масс-спектрометрического анализа их трипсиновых гидролизатов 98
Глава 9. Свойства выделенных пектиназ ПО
9.1. Субстратная специфичность и кинетические параметры действия ферментов 110
9.2. Влияние температуры и рН на активность и стабильность пектиназ 116
9.3. Изучение механизма гидролиза пектинов под действием полигалактуроназ и
пектинл иаз 125
Глава 10. Взаимодействие ферментов при действии на пектины 130
10.1. Явления синергизма и антагонизма в системах полигалактуроназа пектинэстераза и пектинлиаза : пектинэстераза 1
10.2. Глубокий гидролиз пектинов 132
10.2.1. Гидролиз пектинов под действием индивидуальных пектиназ 133
10.2.2. Гидролиз пектинов под действием исходных препаратов Aspergillus 138
10.2.3. Взаимодействие пектиназ (PG 38 Af, РЕ А/и PL Aj) при глубокой деструкции пектинов 140
10.2.4. Взаимодействие пектиназ A. niger при глубокой деструкции пектинов 145
Глава 11. Испытания пектиназ in vitro 148
11.1. Использование пектиназ для осветления яблочного сока 148
11.2. Выявление способности пектиназных препаратов к увеличению питательной
ценности кормов in vitro 152
Выводы 154
Список литературы 156
