ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................................................... 4
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................... 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................. 11
1.1. Пиридоксаль-5’-фосфат-зависимые ферменты ................................................ 11
1.1.1. Свойства пиридоксаль-5’-фосфата в водных растворах ............................ 12
1.1.2. Каталитические свойства пиридоксаль-5’-фосфата ................................... 15
1.2. Механизм реакции трансаминирования ........................................................... 18
1.3. Депротонирование субстрата на стадии трансиминирования ........................ 20
1.4. Пространственная структура трансаминаз и связывание кофактора ............ 23
1.5. Стабильность холофермента трансаминаз ....................................................... 25
1.6. Трансаминазы IV типа укладки ......................................................................... 27
1.7. Канонические и неканонические трансаминазы D-аминокислот .................. 29
1.8. Взаимодействие трансаминаз с ингибитором D-циклосерином .................... 34
1.9. Применение трансаминаз ................................................................................... 36
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................... 41
2.1. Материалы и реактивы ....................................................................................... 41
2.2. Методы работы с ДНК и бактериальными клетками ...................................... 41
2.2.1. Приготовление компетентных клеток E. coli .............................................. 41
2.2.2. Трансформация клеток E. coli ...................................................................... 42
2.2.3. Электрофорез ДНК ........................................................................................ 42
2.2.4. Рестрикция и лигирование плазмидных ДНК............................................. 42
2.2.5. Выделение ДНК из клеток E. coli и из агарозного геля ............................. 43
2.2.6. Сайт-направленный мутагенез ..................................................................... 43
2.2.7. Отбор колоний клеток E. coli ....................................................................... 43
2.3. Методы анализа белков ...................................................................................... 44
2.3.1. Определение концентрации белков ............................................................. 44
2.3.2. Электрофорез белков в денатурирующих условиях .................................. 44
2.3.3. Спектральный анализ .................................................................................... 44
2.4. Получение рекомбинантных форм ферментов ................................................ 45
2.4.1. Клонирование генов ферментов ................................................................... 45
2.4.2. Получение вариантов ТА_Halhyс аминокислотными заменами .............. 45
2.4.3. Препаративная экспрессия генов ферментов .............................................. 46
2.4.4. Выделение и очистка ферментов ................................................................. 47
2.4.5. Получение PLP-формы и PMP-формы холофермента и апофермента ..... 49
2.5. Анализ функциональных свойств ТА_Halhy и вариантов .............................. 49
2.5.1. Определение активности трансаминаз ........................................................ 49
2.5.2. Определение рН- и температурного оптимумов реакций
трансаминирования ................................................................................................................. 52
2.5.3. Определение термостабильности WT ТА_Halhy и вариантов .................. 52
2.5.4. Анализ ингибирования TA_Halhy D-циклосерином .................................. 53
2.5.5. Анализ утечки кофактора из активного центра ТА_Halhy ........................ 54
2.5.6. Определение константы диссоциации PLP-формы холофермента .......... 55
3
2.5.7. Определение выхода продукта и энантиомерного избытка в реакциях стереоселективного аминирования α-кетокислот, катализируемых TA_Halhy ............... 55
2.6. Рентгеноструктурный анализ............................................................................. 58
2.6.1. Получение кристаллов TA_Halhy и вариантов ........................................... 58
2.6.2. Сбор и обработка дифракционных данных. Решение и уточнение структур TA_Halhy и вариантов ............................................................................................................ 59
2.6.3. Анализ кристаллических структур .............................................................. 61
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ ................................................................... 62
1.1. Каталитические свойства трансаминазы из H. hydrossis (ТА_Halhy) ............ 62
1.1.1. Получение TA_Halhy в рекомбинантной форме ........................................ 62
1.1.2. Субстратная специфичность ТА_Halhy в реакциях трансаминирования 63
1.1.3. Термостабильность холофермента и апофермента ТА_Halhy .................. 64
1.1.4. Спектральные свойства TA_Halhy ............................................................... 65
1.1.5. Анализ полуреакций ТА_Halhy c D-аминокислотами ............................... 66
1.1.5.1. Общий ход кинетических кривых и стадия III ........................................... 67
1.1.5.2. Стадии I и II полуреакций TA_Halhy .......................................................... 70
1.1.5.3. Кинетическая схема полуреакций ............................................................... 74
1.2. Структурный анализ ТА_Halhy ......................................................................... 77
1.2.1. Структура холофермента .............................................................................. 77
1.2.2. Cтруктура комплекса TA_Halhy с D-циклосерином .................................. 80
1.3. Свойства вариантов TA_Halhy: взаимосвязь структуры и функции ............. 83
1.3.1. Выбор аминокислотных замен ..................................................................... 83
1.3.2. Участие остатков R28*, R90 и R179 в стабилизации функционального димера и в связывании субстратов ТА_Halhy...................................................................... 83
1.3.3. Структурные детерминанты активности варианта R90I с первичными ароматическими (R)-аминами ................................................................................................ 89
1.3.4. Участие остатков R28*, R90 и R179 в связывании кофактора и стабилизации холофермента .................................................................................................. 91
1.4. Взаимодействие TA_Halhy c D-циклосерином ................................................ 95
1.4.1. Ингибирование ТА_Halhy D-циклосерином ............................................... 95
1.4.2. Анализ продуктов взаимодействия ТА_Halhy с D-циклосерином ........... 97
1.4.3. Реактивация TA_Halhy PLP и α-кетоглутаратом ........................................ 98
1.5. Применение ТА_Halhy в стереоселективном аминировании α-кетокислот101
1.5.1. Оценка эффективности ТА_Halhy в трехферментной системе ............... 101
1.5.2. Стабилизация холофермента ТА_Halhy в реакционных условиях ......... 104
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................... 106
ВЫВОДЫ ................................................................................................................................... 108
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ............................. 109
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................... 112
