Введение
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Периферийный катаболизм ароматических соединений у псевдомонад 9
1.2. Биохимическая характеристика метаболических путей, обусловленных TOL плазмидами
1.2.1. Деградация толуола и его производных у штаммов P. putida .......... 14
1.2.2. Ферменты расщепления толуола и его производных 19
1.2.2.1. Субстратная специфичность ферментов 19
1.2.2.2. Ключевые ферменты 20
1.2.2.3. Катехол-2,3-диоксигеназа 23
1.2.2.4. Катехол-2,3-диоксигеназа, как маркер экспрессии TOL -плазмидных генов .
1.3. Генетическая и молекулярно-биологическая характеристика TOL плазмид 26
1.3.1. Общие свойства и строение TOL плазмид 26
1.3.1.1. Изофункциональность 26
1.3.1.2. Температурочувствительность .... 26
1.3.1.3. Конъогативность 28
1.3.1.4. Образование рекомбинантов с Е плазмидами . . . 30
1.3.1.5. Устойчивость к атомарному кислороду и ультрафиолетовому облучению ... 34
1.3.1.6. Бензоатная элиминация 34
1.3.2. Физическая и генетическая структура плазмиды 37
1.4. Экспрессия TOL -плазмидных генов 41
1.4.I. Доминирование плазмидного пути расщепления ароматических соединений у штаммов P. putida 41
1.4.2. Генетическая регуляция активности a?OL-плазмидных генов . 43
1.4.3. Условия экспрессии TOL -плазмидных
генов 46
1.4.4. Транскрипция генов . . 48
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Основные препараты и реактивы 51
2.2. Штаммы бактерий 53
2.3. Питательные среды 53
2.4. Условия культивирования микробов .... 55
2.5. Условия индукции плазмидных ферментов . . 55
2.6. Определение активности ферментов .... 56
2.6.1. Приготовление бесклеточного экстракта 56
2.6.2. Определение сухого веса бактерий . . 57
2.6.3. Определение активности К230 57
2.6.4. Определение активности гидролазы 2ГМПА 60
2.6.5. Определение активности KI20 60
2.7. Частичная очистка К230 61
2.8. Определение синтеза белка во время индукции активности К230 61
2.8.1. Радиоактивное мечение белков .... 61
2.8.3. Электрофорез белков в ПААГ-е .... 62
2.9. Изучение синтеза РНК во время индукции активности К230 62
32
2.9.1. Включение Р-ортофосфата в клетки бактерий 63
2.9.2. Включение Н-урацила в лабильную РНК 63
2.9.3. Выделение суммарной РНК 64
2.9.4. Анализ препаратов суммарной РНК ... 65
2.10. Выделение TOL -плазмидоспецифической РНК 66
2.ЮЛ. Иммобилизация TOL -плазмидной ДНК на сефарозе 2В 66
2.10.2. Очистка TOL -плазмидоспецифической РНК 66
2.11. Изучение TOL -плазмидной ДНК 67
2.11.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК 67
2.11.2. Анализ плазмидной ДНК 68
2-,11.3. Выделение из геля рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК 69
2.12. Гибридизация РНК-ДНК в капилляре ..... 69
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение динамики индукции активности К230 71
3.1.1. Определение активности К230 71
3.1.2. Стабильность К230 76
3.1.3. Динамика индукции активности К230 ... 78
3.2. Синтез белка во время индукции активности К230 84
3.3.. Синтез РНК во время индукции К230 .... 87
3.3.1. Изучение синтеза лабильных РНК .... 87
3.3.2. Состав РНК, синтезированной во время индукции К230 . 92
3.3.3. Выделение TOL -плазмидоспецифических РНК 96
3.3.4. Изучение динамики синтеза ШОЬ -плазмидо специфических РНК 99
3.4. Локализация активно транскрибируемых участков в геноме плазмиды pwwo 10?
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Индукция активности К230 112
4.2. Транскрипция TOL плазмиды pWWO ..... 118
4.3. Локализация активно-транскрибируемых регионов TOL плазмиды pWWO 124
5. ВЫВОДЫ 128
Литература . 131
