Введение
2. Обзор литературы 15
2.1 Покоящееся состояние клеток M. tuberculosis и латентная туберкулезная инфекция. Патогенез латентного ТБ у человека 15
2.2. Модели латентного ТБ in vivo 20
2.3. Модели латентного туберкулеза in vitro 30
2.4. Методы изучения бактериальных транскриптомов 39
2.5. Механизмы адаптации M. tuberculosis к персистенции и латентному состоянию инфекции. 47
2.6. Реактивация латентного ТБ и факторы, влияющие на «оживление» покоящихся клеток M. tuberculosis 59
2.7. Ингибирование покоящихся клеток M. tuberculosis и предотвращение активации латентной инфекции 72
3. Методы исследования 82
3.1. Объект исследования и условия культивирования 82
3.2. Оценка культивируемости бактерий 82
3.3. Pеактивация «некультивируемых» клеток микобактерий 83
3.4. Микроскопические исследования 83
3.5. Включение радиоактивно меченного урацила в клетки 84
3.6. Определение концентрации АТФ в клетках 85
3.7. Активность эндогенных ДФИ-редуктаз 85
3.8. Транскриптомный анализ методом гибридизации на чипах (microarray) 86
3.9. Полный транскриптомный анализ методом RNA-seq 87
3.10. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qPCR) 89
3.11. Нозерн-блоттинг 89
3.12. Метод удлиннения праймера 89
3.13. Создание штаммов с гиперэкспрессией малых некодирующих РНК 90
3.14. Определение минимальной ингибирующей концентрации соединений 90
3.15. Оценка антибактериальной активности соединений методом диффузии в агаре 91
3.16. Оценка бактерицидного действия соединений 92
3.17. Определение цитотоксичности соединений 93
3.18. Определение содержания меди в клетках микобактерий. 93
3.19. Экстракция комплексов гидроксопиридинтионов с ионами Cu2+ и их метаболитов из культуры M. tuberculosis 94
3.20. Детекция комплексов НРТ с ионами Cu2+ 94
3.21. Выделение и характеристика резистентных к соединению TP053 мутантных клеток M. tuberculosis 95
3.22. Клонирование, экспрессия и очистка белка Rv2466c 95
3.23. Определение оксида азота NO. 96
3.24. Метаболическая трансформация соединения TP053 в клетках M. tuberculosis 97
3.25. Определение внутриклеточной активности соединений 97
4. Результаты и обсуждение 99
4.1. Модель покоящегося состояния M. tuberculosis в условиях отсутствия калия in vitro и характеристика покоящихся клеток 99
4.1.1. Разработка экспериментальной модели перехода M. tuberculosis в покоящееся состояние in vitro 99
4.1.2. Характеристика покоящихся клеток M. tuberculosis 103
4.2. Изучение профиля транскрипции клеток M. tuberculosis при переходе в состояние покоя в условиях дефицита калия in vitro 112
4.2.1. Транскрипционный профиль клеток M. tuberculosis в состоянии покоя методом гибридизации РНК на микрочипах 112
4.2.2. Транскрипционный профиль клеток M. tuberculosis, утративших способность к колониеобразованию, полученный методом RNA-seq 118
4.2.3. Некодирующий транскриптом 132
4.2.4. Возможные функции малых некодирующих РНК MTS0997 и MTS1338 в метаболизме M. tuberculosis 133
4.3 Изучение профиля транскрипции покоящихся клеток M. tuberculosis при их реактивации и реверсии к росту 140
4.3.1. Метод предельных разведений и его применение для количественной оценки числа реактивировавшихся клеток 140
4.3.2. Реактивация покоящихся НК клеток в культуре 141
4.3.3. Определение уровня метаболической активности в процессе реактивации покоящихся НК клеток M. tuberculosis 146
4.3.4. Изменения транскрипционного профиля реактивируемых клеток M. tuberculosis 147
4.3.5. Верификация изменения уровня транскрипции на ранней стадии реактивации клеток M. tuberculosis из состояния покоя 158
4.3.6. Восстановление целостности 23S рРНК в процессе реактивации покоящихся клеток M. tuberculosis 164
4.4. Поиск ингибиторов покоящихся клеток M. tuberculosis 170
4.5. Активность производных нитротиазолов в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis 175
4.6. Активность производных тиазолидинов в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis 180
4.7. Активность производных триазеноиндолов в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis 184
4.8. Активность производных 1-гидрокси-5-R-пиридин-2 (1H) тионов (НРТ) в отношении покоящихся НК клеток M. tuberculosis и механизм их действия 187
4.8.1. Бактерицидная активность производных гидроксипиридин-тионов в отношении активных и покоящихся клеток M. tuberculosis 187
4.8.2. Особенности профиля транскрипции клеток M. tuberculosis в присутствии НРТ-2b. 196
4.8.3. Аккумуляция Cu2+ в клетках микобактерий в присутствии НРТ 200
4.9. Активность производных тиенопиримидинов (ТР) в отношении покоящихся НК клеток M.
tuberculosis и механизм их действия 210
4.9.1. Бактерицидная активность производных тиенопиримидинов отношении активных и покоящихся клеток M. tuberculosis 210
4.9.2. Роль белка Rv2466c M. tuberculosis в антимикобактериальной активности соединения TP053 218
4.9.3. Образование NO в процессе восстановления TP053 219
4.9.4. Особенности профиля транскрипции клеток M. tuberculosis в присутствии TP053 221
4.9.5. Метаболическая трансформация соединения TP053 в клетках M. tuberculosis 227
5. Заключение 232
Приложение 1. Транскриптом покоящихся клеток M. tuberculosis, полученный методом гибридизации на чипах 235
Приложение 2. Транскриптом покоящихся клеток M. tuberculosis, полученный методом секвенирования РНК 237
Приложение 3. Транскриптом клеток M. tuberculosis, реактивирующих из состояния покоя 287
Приложение 4. Гены M. tuberculosis с существенно повышенным уровнем экспрессии в присутствии НРТ-2b 351
Приложение 5. Гены M. tuberculosis с существенно повышенным уровнем экспрессии в присутствии ТР053 362
Список литературы 368
Благодарности 400
