Введение
ГЛАВА 1. Введение 6
Актуальность темы исследования 6
Степень разработанности темы исследования 8
Цели и задачи 11
Научная новизна 12
Теоретическая и практическая значимость работы 13
Методология и методы исследования 14
Положения, выносимые на защиту 15
Степень достоверности и апробация результатов 16
Благодарности 16
ГЛАВА 2. Обзор литературы 18
2.1. Мезенхимные стволовые клетки 18
2.2. Методы изучения мезенхимных клеток-предшественниц 24
2.2.1. Формирование эктопических очагов кроветворения 24
2.2.2 Колониеобразующие единицы фибробластные (КОЕф) 29
2.2.3 Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК)
2.2.3.1. Основные свойства ММСК 34
2.2.3.2. Применение ММСК в клинической практике 37
2.2.4 Длительная культура костного мозга 39
2.3 Иерархия отдела МСК 43
2.4. Способы индивидуального маркирования клеток 50
2.4.1. Радиационное цитогенетическое маркирование 50
2.4.2. Маркирование с помощью вирусных векторов
2.4.2.1. Саузерн-блот гибридизация – рестрикционный анализ сайтов интеграции 53
2.4.2.2. Полимеразная цепная реакция, опосредованная лигированием 55
2.4.2.3. Маркирование с помощью генетических штрих-кодов 57
2.4.3. Комбинации различных стратегий маркирования клеток 61
2.5 Факторы роста и регуляции стромальных клеток-предшественниц 65
2.5.1. Основной фактор роста фибробластов (bFGF) 65
2.5.2. Паратиреоидный гормон (ПТГ) 67
2.5.3. Трансформирующие ростовые факторы (TGF) 68
2.5.4. Фактор некроза опухолей (ФНО) 69
2.5.5. Интерлейкин-1 (ИЛ-1) 70
ГЛАВА 3. Материалы и методы 73
3.1. Животные 73
3.2. Доноры костного мозга 73
3.3. Состав буферов и приготовление реактивов з
3.4. Общие молекулярно-биологические методы 76
3.4.1. Выделение ДНК из тканей животных 76
3.4.2. Выделение ДНК из клеточных культур 76
3.4.3. Выделение РНК 77
3.4.4. Обратная транскрипция 78
3.4.5. Традиционная ПЦР 79
3.4.6. Гель-электрофорез в агарозном геле 80
3.4.7. ПЦР в режиме реального времени 80
3.4.8. Исследование экспрессии генов в формате ПЦР-планшетов 81
3.4.9. ПЦР, опосредованный лигированием (ОЛ-ПЦР) 83
3.4.10. Иммуноферментный анализ 85
3.5. Общие генно-инженерные методы 87
3.5.1. Получение вирусного супернатанта 87
3.5.2. Определение вирусного титра при использовании векторов с флуоресцентными белками 89
3.5.3. Определение вирусного титра при использовании векторов без флуоресцентных белков 89
3.5.4. Заражение исследуемых клеточных популяций лентивирусами 90
3.6. Общие методы клеточной биологии 91
3.6.1. Сортировка клеток с помощью магнитных микрочастиц 91
3.6.2. Проточная цитофлуориметрия 92
3.6.3. Определение пролиферации лимфоцитов с помощью окрашивания CFSE 92
3.6.4. Культивирование клеток 93
3.6.4.1. Культивирование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) 93
3.6.4.2. Подсчёт клеток в камере Горяева 94
3.6.4.3. Индукция ММСК к дифференцировке в остеогенном направлении 95
3.6.4.4. Индукция ММСК к дифференцировке в адипогенном направлении 95
3.6.4.5. Клонирование ММСК 95
3.6.4.6. Получение колониеобразующих единиц фибробластных (КОЕф) из костного мозга 96
3.6.4.7. Получение длительных культур костного мозга (ДККМ) мыши 96
3.6.4.8. Получение КОЕф из подслоя ДККМ 96
3.6.4.9. Анализ клеток образующих области булыжника (CAFC) на 8-е сутки и клеток, инициирующих длительную культуру костного мозга (LTC-IC)
3.7. Формирование очагов эктопического кроветворения под капсулой почки 98
3.8. Комплексные методы 99
3.8.1. Изучение клонального состава МСК в КМ мыши 99
3.8.1.1. Библиотека плазмид со штрих-кодами 99
3.8.1.2. Получение вирусного супернатанта 99
3.8.1.3. Заражение ДККМ библиотекой вирусов 99
3.8.1.4. Клонирование КОЕф и определение последовательности штрих-кодов в КОЕф 100
3.8.1.5. Формирование эктопических очагов кроветворения под капсулой почки 101
3.8.1.6. Подготовка образцов для высокопроизводительного параллельного секвенирования 101
3.8.1.7. Секвенирование Illumina 102
3.8.1.8. Обработка данных Illumina 102
3.8.1.9. Статистический анализ результатов
3.8.2. Определение клонального состава ММСК 104
3.8.3. Исследование стимулирующей рост кроветворного микроокружения активности в облучённых мышах
3.8.3.1. Гамма-облучение животных 105
3.8.3.2. Получение очагов эктопического кроветворения 105
3.8.3.3. Ростовые факторы 106
3.8.3.4. Выделение и культивирование in vitro клеток из костей 106
3.8.3.5. Тестирование стимулирующей рост кроветворного микроокружения активности in vitro 107
3.8.3.6. Обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени 107
3.8.3.7. Иммуноферментный анализ 108
3.8.4. Исследование влияния ИЛ-1 на ММСК человека 108
3.8.4.1. Культуры клеток и характеристики ММСК 108
3.8.4.2. Анализ кроветворных клеток-предшественниц CAFC и LTC-IC в ММСК,
культивированных с ИЛ-1 109
3.8.4.3. Анализ экспрессии генов в ММСК 109
3.8.4.4. Статистический анализ 109
3.8.5. Исследование активации ИЛ-1 в стромальных клетках человека и мыши 110
3.8.5.1. Культивирование ММСК 110
3.8.5.2. Культивирование и облучение ДККМ мыши 110
3.8.5.3. Исследование экспрессии генов сигнального пути NF-kB 111
3.8.5.4. Статистический анализ 111
3.9. Методы статистического анализа 113
ГЛАВА 4. Результаты и обсуждение 114
4.1. Клональный состав мезенхимных стволовых клеток и клеток-предшественниц мыши 114
4.1.1. Исследование возможности маркирования мышиных стромальных клеток предшественниц с помощью лентивирусных векторов 115
4.1.1.1. Маркирование МСК лентивекторами с флуоресцентными белками in vitro 115
4.1.1.2. Маркирование МСК лентивекторами с флуоресцентными белками in vivo 119
4.1.1.3. Маркирование МСК лентивекторами без флуоресцентных белков 124
4.1.2. Исследование клонального состава МСК в костном мозге мышей 129
4.1.2.1. Схема эксперимента 129
4.1.2.2. Допущения в анализе данных NGS
4.1.2.3. Оценка количества штрих-кодов в первичных очагах эктопического кроветворения 134
4.1.2.4. Оценка количества штрих-кодов во вторичных очагах эктопического кроветворения 136
4.1.2.5. Оценка количества МСК в очагах эктопического кроветворения 138
4.2. Исследование свойств ММСК человека 145
4.2.1. Исследование ММСК человека на уровне суммарной клеточной популяции 145
4.2.1.1. Кумулятивная клеточная продукция ММСК человека 146
4.2.1.2. Эффективность клонирования ММСК человека 148
4.2.2. Клональный состав ММСК человека 150
4.2.2.1. Пролиферативный потенциал отдельных клонов немаркированных ММСК 151
4.2.2.2. Серийное клонирование отдельных немаркированных ММСК 153
4.2.2.3. Маркирование ММСК лентивектором 154
4.2.2.4. Клонирование маркированных ММСК 155
4.2.2.5. Определение сайтов интеграции лентивекторов в клонах ММСК 158
4.3. Факторы роста стромального микроокружения у мышей 165
4.3.1. Исследование природы стимулирующей рост кроветворного микроокружения в облучённых мышах 165
4.3.2. ИЛ-1 как ростовой фактор стромального микроокружения у мышей 171
4.4. Факторы роста ММСК человека 178
4.4.1. Влияние ИЛ-1 на клеточную продукцию и эффективность клонирования ММСК 179
4.4.2. Влияние ИЛ-1 на способность ММСК к дифференцировке и их иммуномодулирующие свойства 180
4.4.3. Поддержание кроветворных клеток-предшественниц ММСК, культивированными с ИЛ-1 182
4.4.4. Влияние ИЛ-1 на экспрессию генов, отвечающих за взаимодействие ММСК с кроветворными клетками 184
4.5. Механизм активации ИЛ-1 в стромальных клетках-предшественницах человека и мыши 189
4.5.1. Исследование роли сигнального пути NF-kB в активации экспрессии ИЛ-1 на модели человеческих ММСК 189
4.5.2. Исследование роли сигнального пути NF-kB в активации ИЛ-1 на модели мышиных ДККМ 193
4.6. Построение иерархического древа МСК 205
Заключение 213
Выводы 217
Список сокращений и условных обозначений 218
Список литературы 221
