Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1. Молекулярно-генетические различия между токсигенными и нетоксигенными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор 21
1.2. Факторы патогенности и персистенции нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор 28
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Материалы 36
2.1.1. Бактериальные штаммы 36
2.1.2. Питательные среды и реактивы 38
2.2. Методы 39
2.2.1. Культивирование бактериальных штаммов 39
2.2.2. Определение растворимой гемагглютинин/протеазы и термолабильного гемолизина 39
2.2.3. Оценка продукции холерного токсина с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза и иммуноферментного метода GM1 ELISA 39
2.2.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов 41
2.2.5. Ненаправленный транспозонный мутагенез (TnphoA) холерного вибриона 41
2.2.6. Полимеразная цепная реакция 42
2.2.7. Выделение РНК и обратная транскрипция 44
2.2.8. Выделение геномной ДНК и полногеномное секвенирование 44
2.2.9. Филогенетический анализ 45
2.2.10. Статистические методы 45
Глава 3. Вариабельность генома нетоксигенных штаммов холерных вибрионов биовара Эль Тор, изолированных на территории Российской Федерации и сопредельных стран 47
3.1. Анализ полногеномных последовательностей природных нетоксигенных штаммов, выделенных на территории Российской Федерации и сопредельных стран 47
3.2. Особенности структуры геномов нетоксигенных штаммов ctxA–tcpA+ из эндемичных по холере регионов 68
3.3. Филогенетическая связь нетоксигенных штаммов с разным генотипом (ctxA–tcpA–VSP–, ctxA–tcpA+VSP–, ctxA–tcpA+VSP+) с токсигенными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор 72
Глава 4. Разработка способа дифференциации нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор с различной эпидемической значимостью методом мультиплексной полимеразной цепной реакции 77
4.1. Поиск ДНК мишеней и подбор оптимальных условий проведения мультиплексной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов 77
4.2. Оценка специфичности и эффективности разработанного способа дифференциации штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор с различной эпидемической значимостью 82
Глава 5. Использование нетоксигенного штамма V. cholerae О1 биовара Эль Тор для получения авирулентного штамма, продуцирующего в субъединицу холерного токсина 89
5.1. Получение нетоксигенного генетически измененного штамма V. cholerae O1 биовара Эль Тор Р18899CTXTox–Hly– методом ненаправленного транспозонного мутагенеза 89
5.2. Введение в клетки нетоксигенного Hly– штамма рекомбинантной плазмиды с клонированным геном ctxB, кодирующим В-субъединицу холерного токсина и оценка продукции этого белка 92
5.3. Изучение генетического контроля экспрессии гена ctxB в клетках сконструированного авирулентного штамма холерного вибриона методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени 96
Заключение 99
Выводы 106
Список используемых источников 108
