Введение
1. Обзор литературы
1.1. Микроорганизмы и условия стресса. 9
1.1.1. Температура как фактор стресса. 11
1.1.2. рН среды роста как фактор стресса . 14
1.1.3. Высокие концентрации солей как фактор стресса. 17
1.1.4. Изменение концентрации кислорода как фактор стресса. 19
1.1.5. Давление как фактор стресса. 19
1.1.6. Влияние химических факторов. 20
1.1.7. Влияние радиации. 21
1.2. Биотехнологическое применение организмов, выращенных в 21 условиях стресса.
1.3. Нитратредуктаза - ключевой фермент азотного метаболизма. 25
1.3.1. Ассимиляторная нитратредуктаза бактерий (Nas). 27
1.3.2. Дыхательная мембранносвязанная нитратредуктаза бактерий (Nar). 30
1.3.3. Диссимиляторная периплазматическая нитратредуктаза бактерий (Nap) 33
1.3.4. Ассимиляторная нитратредуктаза (Euk-NR) эукариот. 36
1.3.5. Дисимиляторная нитратредуктаза эукариот. 38
1.4. Строение активного центра нитратредуктазы. 39
1.5. Изменение свойств и структуры нитратредуктазы под воздействием факторов стресса. 41
2. Материалы и методы исследования
2.1. Реактивы, используемые в работе. 45
2.2. Объекты исследований и условия их выращивания. 45
2.2.1. Fusarium oxysporum штамм 11 dn 1. 45
2.2.2. Дрожжи Rhodotorula glutinis. 46
2.2.3. Бактерии Haiomonas sp. штамм AG J 1-3. 46
2.3. Получение бесклеточного экстракта. 47
2.4. Выделение и очистка нитратредуктазы дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенных в присутствии 1 мМ вольфрамата. 47
2.5. Определение активности нитратредуктазы. 48
2.5.1. Определение активности метилвиологензависимой нитратредуктазы 48
2.5.2. Определение активности NADH- и NADPH- зависимой нитратредуктазы. 49
2.6. Определение наличия молибдокофактора. 49
2.7. Определение молекулярной массы белков методом гельхроматографии. 50
2.8. Определение молекулярной массы и субъединичного состава белков методом электрофореза. 50
2.9. Определение ферментативной активности в ПААГ. 51
2.10. Определение вольфрама кинетическим методом . 51
2.11. Аналитические методы. 53
3. Результаты исследования и их обсуждение.
3.1. Влияние парциального давления кислорода на свойства нитратредуктаз гриба Fusarium oxysporum 11 dn1. 57
3.1.1. Изменение функциональных характеристик HP-азы у микро-скопических грибов при стрессовых условиях (снижение парциального давления кислорода). 57
3.1.2. Физиолого-биохимические характеристики гриба F. oxysporum 11dn1 в аэробных и анаэробных условиях. 60
3.1.3. Сравнение свойств HP-аз мицелия гриба F. oxysporum 11dn1, инкубируемого на нитрате в аэробных и анаэробных условиях. 62
3.1.4. Влияние циклогексемида на активность HP-азы гриба F. oxysporum 11dn1, инкубируемого в аэробных и анаэробных условиях на среде, содержащей нитрат. 66
3.2. Выделение, очистка и характеристика нитратредуктазы из клеток солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis,выращенных в присутствии вольфрамата. 69
3.2.1. Влияние высоких (1 мМ) концентраций вольфрамата на рост дрожжей Rh. glutinis 69
3.2.2. Характеристика препарата нитратредуктазы из экстракта клеток дрожжей Rh. glutinis, выращенных на 1 мМ вольфрамате. 70
3.2.3. Выделение и очистка нитратредуктазы. 74
3.2.4. Структура и свойства выделенной нитратредуктазы. 74
3.2.5. Защитные механизмы, обеспечивающие устойчивость дрожжей Rh. glutinis к 1 мМ вольфрамату. 82
3.3. Выделение и характеристика новой, не содержащей молибден нитратредуктазы из галоалкалофильной бактерии Haiomonas sp. штамм AG J 1-3.
3.3.1. Выделение и очистка НР-азы из клеток галоалкалофильнои бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 84
3.3.2. Физико-химические свойства НР-азы из клеток галоалкалофильнои бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 86
3.3.3. Спектр ферментативной активности НР-азы бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 89
3.3.4. Анализ структуры НР-азы бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3. 93
4. Заключение. 100
5. Выводы. 101
Список работ, опубликованных по теме диссертации. 102
6. Список литературы. 103
