Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая история иммуноферментного анализа (ИФА) 11
1.1.1. Изобретение радиоиммунологического анализа (РИА) 11
1.1.2. Возможность использования ферментной метки в иммунохимическом анализе 12
1.1.3. Открытие способа получения моноклональных антител методом слияния клеток 14
1.1.4. Краткий обзор последних достижений и дальнейшего развития иммуноферментного анализа 18
1.2. Особенности иммунохимических процессов в «классических» твердофазных ИФА 25
1.2.1. Скорость реакций 26
1.2.2. Формирование монослоя иммобилизованных молекул на твердой фазе 27
1.2.3. Вопрос о прочности прикрепления молекул к твердой фазе и друг к другу в твердофазных ИФА 29
1.2.4. Образование прочных циклических иммунных комплексов в сэндвич-методе 32
1.2.5. Иммунохимические факторы, определяющие аналитическую чувствительность твердофазных ИФА 32
1.2.6. Проблема инактивации антител при пассивной адсорбции на твердой фазе 37
Глава 2. Методы исследований и использованные материалы 43
2.1. Использованные материалы 43
2.2. Методы исследований 43
2.2.1. Получение гибридом - продуцентов моноклональных антител 43
2.2.2. Определение антигенсвязывающей активности моноклональных антител с антигеном, адсорбированным на поверхность планшетов из полистирола 44
2.2.3. Очистка моноклональных антител с помощью ионообменной хроматографии 45
2.2.4. Определение белка 45
2.2.5. Приготовление конъюгата р24ВИЧ с LC-LC-биотином 45
2.2.6. Адсорбция антител на поверхность планшетов для определения антигенсвязывающей активности антител 46
2.2.7. Определение оптимального рН адсорбции тестируемых антител 46
2.2.8. Определение оптимальной концентрации антител в адсорбционных растворах при иммобилизации моноклональных антител на поверхность планшетов 46
2.2.9. Определение антигенсвязывающей активности иммобилизованных моноклональных антител 47
2.2.10. Количественное определение относительной антигенсвязывающей активности антител 47
2.2.11. Приготовление антител и HBsAg, меченных 125I 47
2.2.12. Определение концентрации 125I-HBsAg 48
2.2.13. Определение количества антител, адсорбированных на поверхности планшетов из полистирола 48
2.2.14. Радиоиммунологическое определение количества антител, сохранивших антигенсвязывающую активность после адсорбции 49
2.2.15. Конъюгация антител с флуоресцентным красителем Су5 50
2.2.16. Определение количества меченых Су5 моноклональных антител, иммобилизованных на поверхность планшетов при использовании адсорбционных буферов с различными значениями рН 50
2.2.17. Определение поверхностной концентрации иммунных комплексов, образованных при различных условиях адсорбции антител 51
2.2.18. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-ПААГ) 52
2.2.19. Статистическая обработка данных 52
Глава 3. Результаты исследований 53
3.1. Получение гибридом – продуцентов моноклональных антител к белку р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 53
3.2. Очистка моноклональных антител и их характеристика 53
3.3. Оценка чистоты моноклональных антител 54
3.4. Отбор моноклональных антител, пригодных для анализа в качестве адсорбируемых 57
3.5. Определение оптимального рН адсорбции иммобилизуемых антител в условиях избыточной насыщающей концентрации 59
3.6. Подбор оптимальных насыщающих концентраций тестируемых антител при оптимальном рН адсорбции 60
3.7. Определение относительной антигенсвязывающей активности антител после адсорбции на поверхность планшетов (при оптимальной насыщающей концентрации антител в адсорбционном буфере) 64
3.8. Определение доли активных антител в общем количестве моноклональных антител, адсорбированных на поверхность планшетов 70
3.9. Определение количества антител, адсорбированных на поверхности полистироловых планшетов при различных рН с использованием меченых 125I антител 78
3.10. Определение количества антител, сохраняющих активность после адсорбции на поверхность полистироловых планшетов при разных значениях рН 81
Обсуждение. 89
Выводы 102
Список сокращений 103
Список литературы 104
