Введение
ГЛАВА1 CLASS . Обзор литературы CLASS 10
1.1 Внутренние стандарты 10
1.1.1 Амплификационные методы определения вирусных нуклеиновых кислот 10
1.1.2 Количественное определение нуклеиновых кислот 10
1.1.3 Метод лимитирующих разведений 11
] .1.4 Конкурентная ПЦР 12
1.1.5 Real-time ПЦР 13
1.1.6 Внутренние стандарты 15
1.1.7 Свободные РНК и ДНК-стандарты 16
1.1.8 Биологические стандарты 17
1.1.9 Генноинженерные стандарты 18
1.1.10 Армированные РНК-стандарты 18
1.1.11 Стандарты для мутационного анализа 21
1.1.12 Скрининг продуктов крови 21
1.1.13 Стандарты для множественных методов 22
1.2 Ретровирусы 22
1.2.1 Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы MuLV 23
1.2.2 Принципы конструирования ретровирусных векторов 25
1.2.3 Упаковывающие клетки 27
1.3 Природа вируса гепатита С 30
1.3.1 Организация генома HCV.. 30
1.3.2 Вариабельность генома HCV и его генотипы 32
1.3.3 Клиническое значение генотипов НСV 33
1.3.4 Вакцина против НСV 36
1.3.5 Вирусная репликация 37
1.3.6 Решшкационный цикл 38
1.3.7 Динамика репликации 39
1.3.8 Определение РНК НС V при остром и хроническом гепатите С.. 40
1.3.9 Мониторинг уровня РНК HCV в течение терапии 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1 Образцы сывороток 47
2.2 Определение РНК HCV в сыворотке крови 47
2.3 Выделение РНК HCV из сыворотки крови 47
2.4 Обратная транскрипция и «nestecb-ПЦР 48
2.5 Детекция продуктов амплификации 48
2.6 Праймеры 49
2.7 Конструирование внутреннего стандарта 49
2.8 Получение пакующей клеточной линии 56
2.9 Использование внутреннего стандарта для качественного определения и генотипирования РНК HCV 59
2.10 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV 59
2.11 Использование внутреннего стандарта в экспериментах с разведенными сыворотками 60
ГЛАВА 3. Результаты 61
3.1 Конструирование внутреннего стандарта 61
3.2 Получение пакующей линии клеток 62
3.3 Определение титра ретровирусных частиц 63
3.4 Чувствительность метода 63
3.5 Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV 64
3.6 Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV 65
3.7 Статистическая обработка количественных измерений 68
3.8 Анализ динамики вирусной концентрации на примере разведенных сывороток 70
ГЛАВА 4. Обсуждение 73
4.1 Преимущества внутреннего стандарта на основе ретровирусного вектора 73
4.2 Сравнение эффективности амплификации двух матриц разного размера 76
4.3 Полуколичественное определение 78
4.4 Использование внутреннего стандарта для сывороток разных генотипов 79
4.5 Использование внутреннего стандарта при качественном и количественном определении PHKHCV 80
Заключение 81
Выводы 82
Список публикаций по теме диссертации 82
Список литературы 84
