Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. HER2/neu как мишень в противоопухолевой терапии 12
1.1.1. Роль HER2/neu в развитии опухолей 12
1.1.2. Механизм действия трастузумаба 12
1.1.3. Терапия трастузумабом 13
1.1.4. Терапия комбинаций трастузумаба и химиопрепаратов 13
1.2. Получение рекомбинантных антител 13
1.2.1. Гибридомные технологии 13
1.2.2. Химерные АТ 15
1.2.3. Гуманизированные АТ 16
1.2.4. Системы экспрессии мАт 18
1.3. Получение рекомбинантных белков из растительного источника 23
1.4. Растительные системы экспрессии мАт 25
1.4.1.Технологии стабильной экспрессии рекомбинантных белков 27
1.4.2. Транзиентная экспрессия рекомбинантных белков 28
1.4.3. Количество и качество получаемого белка 34
1.4.4. Проблемы гликозилирования 34
1.4.5. Получение терапевтических рекомбинантных белков из трансгенных растений 38
1.5. Преимущества и недостатки растений как платформы для получения фармацевтических рекомбинантных белков 40
1.6. Заключение 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Векторные конструкции 45
2.2. Nicotiana benthamiana L. – Табак Австралийский 45
2.3. Среды для культивирования бактерий 45
2.4. Агроинфекция 46
2.5. Экстракция целевого белка из листьев Nicotiana benthamiana 46
2.6. Скрининг белка 47
2.6.1. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 47
2.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА) 48
2.6.3. Исследование аффинности к экстрациллюлярному домену HER2/neu методом ELISA 49
2.6.4. Исследование анти-HER2 фитоантител методом двумерного белкового электрофореза 49
2.6.5. Вестерн-блоттинг 50
2.6.6. Мечение антител FITC 51
2.6.7. Проточная цитофлуориметрия 52
2.7. Очистка целевого белка, полученного из растительного источника 53
2.8. Гель-фильтрационная хроматография белка 54
2.9. Контроль на наличие эндотоксинов методом ЛАЛ-теста 54
2.10. Определение пирогенности анти-HER2 фитоантител на кроликах 57
2.11. Иммуноцитохимический анализ гиперэкспрессии антигена HER2 с помощью анти-HER2 фитоантител 57
2.12. Концентрирование проб, содержащих белок 59
2.13. Статистическая обработка результатов 59
Глава 3. Результаты собственных исследований 60
3.1. Получение и очистка анти-HER2-фитоантител 60
3.1.1. Наработка растительного материала 60
3.1.2. Экстракция и первичная очистка анти-HER2 фитоантител 62
3.1.3. Разработка протоколов хроматографической очистки анти-HER2 фитоантител 67
3.2. Анализ биохимических свойств анти-HER2 фитоантител 75
3.2.1 Анализ электрофоретической подвижности в ПААГ 75
3.2.2 Анализ электрофоретической подвижности анти-HER2 фитоантител методом двумерного белкового электрофореза 78
3.2.3 Анализ специфической активности анти-HER2 фитоантител in vitro 80
3.2.4 Сравнение эффективности специфического связывания анти-HER2 фитоантител и трастузумаба с антигеном HER2 81
3.2.5. Анализ эффективности связывания анти-HER2 фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2 86
3.3. Анализ пирогенности полученных анти-HER2 фитоантител 91
3.4. Заключение 92
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 94
Выводы 106
Список сокращений 107
Список литературы 109
Приложение 128
